一种量子点与重组人内皮抑制素偶联物及其制备工艺制造技术

本发明专利技术提供一种量子点与重组人血管内皮抑制素偶联物及其制备工艺，本发明专利技术采用量子点通过碳二亚胺法与目标蛋白重组人血管内皮抑制素进行反应，通过调整偶联摩尔比以及偶联的环境等实现量子点与重组人血管内皮抑制素的偶联以达到其最高偶联效率，本发明专利技术所述偶联制备工艺制备的量子点与重组人血管内皮抑制素偶联物，能够大大提高量子点与重组人血管内皮抑制素的偶联效率，可为研究重组人血管内皮抑制素的体内示踪提供依据；并且本发明专利技术的制备方法生产成本低、制备工艺简单、适用于大规模的工业化生产。

A coupling compound of quantum dots and recombinant human endostatin and its preparation process

【技术实现步骤摘要】
一种量子点与重组人内皮抑制素偶联物及其制备工艺
本专利技术属于药物领域，具体涉及一种量子点与重组人血管内皮抑制素偶联物及其制备工艺。
技术介绍
重组人血管内皮抑制素rhEndostatin,rh-ES目前在临床上广泛应用，但由于上市的只有普通的注射剂，其稳定性比较差，需要频繁的给药。而传统偶联制备工艺如静电吸附，虽然操作简单、无需添加其它反应试剂，但该方法制备的复合物稳定性较差，偶联效率低且长期保存困难，严重影响其活性，难以实现成药性，并且靶向性评价困难。所以需要新型的较温和的制备工艺，降低对蛋白活性的影响，与此同时蛋白给药体系的构建以及对其靶向性进行评价，这些都是重组人血管内皮抑制素新型剂型研究的关键所在。
技术实现思路
针对上述技术问题，本专利技术提供一种量子点与重组人血管内皮抑制素偶联物及其制备工艺，以量子点QDs为成像材料，通过将QDs与重组人血管内皮抑制素rh-ES进行共价结合，得到蛋白与量子点结合的复合物，使该复合物具有量子点的荧光特性和蛋白类药物的生物活性。共价结合是量子点的羧基与蛋白的氨基通过缩合反应形成共价键，结合力强，得到的复合物稳定性好并且光学性能保持较好。本专利技术将重组人血管内皮抑制素与量子点等示踪剂通过碳二亚胺法进行偶联，反应条件比较温和不会对蛋白活性产生影响且有利于后期的靶向性评价。本专利技术提供的量子点与重组人血管内皮抑制素偶联物制备工艺偶联效率较高。本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：一种量子点与重组人血管内皮抑制素偶联物制备工艺，包括以下步骤：<br>偶联物以量子点作为示踪剂，以重组人血管内皮抑制素为模型药，将活化后的量子点与重组人血管内皮抑制素蛋白进行偶联反应，制备得到量子点与重组人血管内皮抑制素偶联物。上述方案中，所述量子点的活化步骤具体为：取量子点QDs溶液，稀释后，分别加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC和N-羟基硫代琥珀酰亚胺NHS，以活化量子点表面的羧基，得到溶液A；所述量子点与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC的摩尔比例为1:500～5000；所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC与N-羟基硫代琥珀酰亚胺NHS的偶联摩尔比例为1：1。上述方案中，所述量子点QDs与重组人血管内皮抑制素蛋白进行偶联反应的步骤具体为：将溶液A中加入重组人血管内皮抑制素蛋白溶液进行偶联反应，将标记蛋白与未标记蛋白分离纯化，得到溶液B。进一步的，所述重组人血管内皮抑制素蛋白溶液的浓度为5mg/mL。进一步的，所述量子点QDs与重组人血管内皮抑制素的摩尔比例1:1～2.5。进一步的，所述偶联反应的时间为1～4h。进一步的，所述量子点为水溶性量子点。上述方案中，还包括以下步骤：将溶液B中加入体积质量百分比为2％牛血清蛋白BSA溶液涡旋2min，用来闭合量子点表面未与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC与N-羟基硫代琥珀酰亚胺NHS偶联的羧基。一种量子点与重组人血管内皮抑制素偶联物，利用所述量子点与重组人血管内皮抑制素偶联物制备工艺制得。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：本专利技术将量子点通过碳二亚胺法偶联在重组人血管内皮抑制素上，在不影响蛋白药物生物活性与量子点光学性能的基础上，不仅有利于对蛋白药物进行靶向行评价，也为蛋白给药体系的构建提供了更多的可能性。本专利技术制备工艺条件下制备的偶联物稳定性良好，反应温和简便易操作，本专利技术提供的制备方法根据现有药学上可接受的生产条件，制备工艺简单并适用于大规模的工业化生产。附图说明本专利技术的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：图1为实施例2中制备的量子点与重组人血管内皮抑制素偶联物与重组人血管内皮抑制素的琼脂糖凝胶电泳图；图2为实施例2中制备的量子点与重组人血管内皮抑制素偶联物与重组人血管内皮抑制素的圆二色光谱图。具体实施方式下面结合附图详细描述本专利技术的实施例，但本专利技术的保护范围不限于此。本专利技术所述量子点与重组人血管内皮抑制素偶联物以及其制备工艺，以量子点QDs为成像材料，通过将其与重组人血管内皮抑制素rh-ES进行共价结合，得到蛋白与量子点结合的复合物，使该复合物具有量子点的荧光特性和蛋白类药物的生物活性。本专利技术提供的量子点与重组人血管内皮抑制素偶联物制备工艺偶联效率较高。所述量子点QDs与重组人血管内皮抑制素偶联物由量子点提供羧基官能团，由蛋白提供氨基官能团，通过碳二亚胺法制备而成；其中，所述的量子点与EDC的偶联摩尔比例为1:500～5000，量子点与重组人血管内皮抑制素的偶联摩尔比例为1:1～2.5，偶联反应时间为1～4h，在这样的制备工艺条件下将量子点通过碳二亚胺法偶联在重组人血管内皮抑制素上，在不影响蛋白药物生物活性与量子点光学性能的基础上，不仅有利于对蛋白药物进行靶向行评价，也为蛋白给药体系的构建提供了更多的可能性。本专利技术制备的偶联物稳定性良好，反应温和简便易操作。所述量子点与重组人血管内皮抑制素偶联物的制备方法，具体包括以下步骤：量子点的活化，取浓度为8μM/LQDs溶液，用pH值为7.4的BBS稀释四倍后，分别加入EDC和NHS，其中EDC和NHS的溶液需现配，涡旋15min以活化量子点表面的羧基，得到活化后的量子点溶液A；量子点QDs与重组人血管内皮抑制素蛋白进行偶联反应，将溶液A中加入5mg/mL的重组人血管内皮抑制素蛋白溶液，继续涡旋片刻后，在振速为250r/min，恒温震荡仪下常温进行振荡反应。反应结束后先通过超滤除去多余的EDC与NHS，再通过5000r/min，4℃条件下高速离心8min，实现标记蛋白与未标记蛋白分离纯化，得到量子点与重组人血管内皮抑制素蛋白偶联物溶液B；封闭作用提高偶联效率，将溶液B中加入体积质量百分比为2％BSA溶液涡旋2min，用来闭合量子点表面未与EDC与NHS偶联的羧基，以免偶联物自身团聚反应，减低偶联效率，反应完全后即可闭光放入冰箱冷藏层保存备用。优选的，所述量子点的活化步骤中量子点与EDC的偶联摩尔比例为1：500～1：5000；其反应环境为pH7.4的硼酸缓冲液。所述量子点的活化步骤中所述EDC与NHS的反应摩尔比例为1：1。所述量子点的活化步骤中活化时间为15min。所述量子点QDs与重组人血管内皮抑制素蛋白进行偶联反应步骤中量子点与重组人血管内皮抑制素的偶联摩尔比例为1：1～1：2.5；反应在恒温震荡仪下的反应时间为1～4h；反应结束后先通过超滤除去多余的EDC与NHS，再通过高速离心法实现标记蛋白与未标记蛋白分离纯化。本专利技术还提供一种量子点与重组人血管内皮抑制素偶联物，所述量子点与重组人血管内皮抑制素偶联物利用本专利技术所述量子点与重组人血管内皮抑制素偶联物制备工艺制得。本专利技术采用量子点通过碳二亚胺法与目标蛋白重组人血管内皮抑本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种量子点与重组人血管内皮抑制素偶联物制备工艺，其特征在于，包括以下步骤：/n偶联物以量子点作为示踪剂，以重组人血管内皮抑制素为模型药，将活化后的量子点与重组人血管内皮抑制素蛋白进行偶联反应，制备得到量子点与重组人血管内皮抑制素偶联物。/n

【技术特征摘要】
1.一种量子点与重组人血管内皮抑制素偶联物制备工艺，其特征在于，包括以下步骤：
偶联物以量子点作为示踪剂，以重组人血管内皮抑制素为模型药，将活化后的量子点与重组人血管内皮抑制素蛋白进行偶联反应，制备得到量子点与重组人血管内皮抑制素偶联物。


2.根据权利要求1所述的量子点与重组人血管内皮抑制素偶联物制备工艺，其特征在于，
所述量子点的活化步骤具体为：
取量子点QDs溶液，稀释后，分别加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC和N-羟基硫代琥珀酰亚胺NHS，以活化量子点表面的羧基，得到溶液A；
所述量子点与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC的摩尔比例为1:500～5000；
所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC与N-羟基硫代琥珀酰亚胺NHS的偶联摩尔比例为1：1。


3.根据权利要求2所述的量子点与重组人血管内皮抑制素偶联物制备工艺，其特征在于，所述量子点QDs与重组人血管内皮抑制素蛋白进行偶联反应的步骤具体为：
将溶液A中加入重组人血管内皮抑制素蛋白溶液进行偶...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘宏飞，陈小艳，杜坤宇，
申请(专利权)人：江苏大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32