一种利用钩藤不定芽诱导四倍体植株的方法技术

本发明专利技术涉及一种中药材的多倍体培养方法，具体为一种利用钩藤不定芽诱导四倍体植株的方法，依次通过不定芽的无菌培养、多倍体诱导、嵌合体分离培养、四倍体筛选、四倍体扩增以及四倍体生根步骤实现，本发明专利技术采用了独特的多倍体诱导液、嵌合体分离培养培养基、增殖培养基及生根培养基，本方法的钩藤四倍体诱导率为18%，经90~180天即可获得大量四倍体钩藤种苗，种苗在形态上根、茎、叶均明显增粗增厚，经栽植后植株明显矮化，植株的抗旱抗逆能力显著提升，药材亩产量提高50~100%，钩藤总碱含量较原母种提高0.12%。

A method of inducing tetraploid plants with adventitious buds of Uncaria

【技术实现步骤摘要】
一种利用钩藤不定芽诱导四倍体植株的方法
本专利技术涉及一种中药材的多倍体培养方法，属于植物作物育种及中药材种植领域，特别涉及钩藤的多倍体培养方法。
技术介绍
钩藤（Uncariarhynchophylla（Miq.）Miq.exHavil.）为茜草科钩藤属属多年生木质藤本植物，以带钩茎枝入药，有熄风定惊，清热平肝的功效，主要用于肝风内动，惊痫抽搐，高热惊厥，小儿惊啼，妊娠子痫，头疼眩晕等症。现代医药研究其内含钩藤碱，有降血压、抗血小板凝聚和抗血栓的功效，用于治疗部分心脑血管疾病。目前以钩藤为原料药的中药制剂约170余种，药材年需求量大。野生主要分布于云南、广东、广西、贵州、福建、湖南、湖北、江西等地，云南产地生于海拔1300~1900m的山谷溪边的疏林或灌木丛中。目前贵州、广西已形成一定规模种植。近年来，随着其开发用途的增加以及疗效的临床认可度提高，需求量逐年上升，钩藤药材价格亦随之上升，目前的种植规模产能已不能满足市场需求。传统的繁殖方式主要有种子繁殖和扦插繁殖，种子繁殖存在繁殖周期长、种质性状不稳定等缺点，而扦插繁殖具有繁殖率低，种苗及种植过程中病虫害严重等缺点。同时，钩藤在各企业药材标准中大部分有钩藤碱含量检测指标，由于钩藤品种较多，即使同种不同品种间差异亦较大，使得药材质量参差不齐。多倍体是普遍存在于自然界中，是生物自身体细胞中具有三个或三个以上的染色体，常见于高等植物中，许多植物在进化的过程都经历了“多倍体化”与“二倍体化”。由于多倍体具有营养器官巨大性、抗逆性增强、生长率提高、有效成分含量增加等特点，因此，多倍体是作物育种的重要方式，亦是药用植物育种的重要方向，目前许多重要的粮食作物和经济作物都是多倍体。自然界中虽然多倍体广泛存在，但数量有限，而通过人工诱导，可以在短期内大量扩增。目前人工诱导多倍体的方式主要有化学诱导、物理诱导，其中以化学诱导因其操作简便、专一性强等优点，是最为有效且应用最为广泛的方法。一方面钩藤中所含有效成分钩藤碱是钩藤内含成分应用最为广泛的物质，其含量也是国家以及企业检测钩藤药材是否达标的最重要指标，同时，钩藤碱含量越高，其药材价格以及价值也越大。另一方面，钩藤一般以钩为单位采收，而按目前钩藤的种植参数，钩藤亩产钩量仅为40~80千克，产量较低，制约了钩藤产业的发展。
技术实现思路
本专利技术针对上述现有钩藤种植产业的不足，利用现代作物育种及生物技术，对钩藤进行染色体加倍，获得钩藤四倍体，增加了钩藤单位面积产量以及药用价值。本专利技术是通过以下技术方案实现的：1、无菌不定芽的培养：（1）选取健壮、无病虫害钩藤幼嫩芽，用饱和肥皂水溶液涮洗10~15min，后用自来水冲洗3-4次至无肥皂液残留，加适量水，再加2~3滴吐温-80，振摇10~15min，用自来水冲淋50~60min；（2）转移至超净工作台内，加入75%酒精振摇15~20s，无菌水涮洗3~4次，再加入0.1%升汞溶液振摇5~7min，无菌水涮洗6~8次，用无菌纸吸去外植体表面水分；（3）将消毒完成幼嫩芽，接种于1/2MS+NAA0.1~0.5mg/L+BA3.0~5.0mg/L的诱导培养基中，在温度23~27℃，光照强度1000~2000lux，单日光照时间10h的环境下培养20~30天。2、不定芽的多倍体诱导：将诱导出的不定芽，剪成单芽，浸泡于含0.2%二甲基亚砜的0.1~0.15%的秋水仙素溶液中，置于23~27℃下无光照环境下诱导24~48h。3、嵌合体分离培养：将诱导出的嵌合体，接种于MS+NAA0.01~0.05mg/L+KT2.0~4.0mg/L+BA1.0~2.0mg/L的分离培养基中，在温度23~27℃，光照强度2000~3000lux，单日光照时间10h环境下培养20~30天。4、四倍体筛选：分离培养的嵌合体，以形态上表现为叶片肥厚、茎增粗的植株，作为筛选对象，取其叶片作为鉴定材料，采用染色体压片计数法进行鉴定，筛选出具有2对染色体的植株。5、四倍体扩增：将筛选出的四倍体，剪成具1~2芽茎段，接种于MS+NAA0.01~0.05mg/L+KT2.0~4.0mg/L+BA1.0~2.0mg/L的增殖培养基中，在温度23~27℃，光照强度2000~3000lux，单日光照时间10h的环境下培养50~60天。6、四倍体的生根：将经筛选或扩增的四倍体，剪成具有2~3芽的茎段，接种于1/2WPM+NAA0.5~2.0mg/L+IBA0~2.0mg/L+活性炭0.5~1.0g/L的生根培养上，在温度23~27℃，光照强度3000~4000lux，单日光照时间12h环境下培养25~35天。本专利技术的有益效果在于：本专利技术利用秋水仙素对钩藤无菌不定芽进行多倍体诱导，后通过形态学鉴定法和染色体压片法筛选并纯化培养获得四倍体钩藤，四倍体诱导率为18%，经90~180天即可获得大量四倍体钩藤种苗。本专利技术的四倍体钩藤，在形态上根、茎、叶均明显增粗增厚，经栽植后植株明显矮化，植株的抗旱抗逆能力显著提升，便于日常管理及药材的采摘。本专利技术的四倍体钩藤，经种植四年后，其所产的药用钩及带钩茎段，均明显增大增粗，间接提高了单位面积结钩率，药材亩产量提高50~100%。本专利技术的四倍体钩藤，经种植四年后，进行钩藤碱检测，其钩藤总碱含量较原母种提高0.12%左右，在很大程度上增加了药材的价格和药用价值。具体实施方式下面结合实例，对本专利技术做进一步的说明。本专利技术的实施方式包括但不限于下列实施实例。实施例1：1、无菌不定芽的培养：（1）选取健壮、无病虫害钩藤幼嫩茎，将其剪成2~3cm带芽茎段，用饱和肥皂水溶液涮洗10，后用自来水冲洗3次至无肥皂液残留，加适量水，再加2滴吐温-80，振摇15min，用自来水冲淋60min；（2）转移至超净工作台内，加入75%酒精振摇15s，无菌水涮洗3次，再加入0.1%升汞溶液振摇6min，无菌水涮洗8次，用无菌纸吸去外植体表面水分；（3）将消毒完成幼嫩芽，剪取伤口部位，按极性接种于1/2MS+NAA0.1mg/L+BA3.0mg/L的诱导培养基中，在温度23~27℃，光照强度1000~2000lux，单日光照时间10h的环境下培养20天，发芽率为85.2%。2、不定芽的多倍体诱导：将诱导出的不定芽，剪成单芽，浸泡于含0.2%二甲基亚砜的0.1%的秋水仙素溶液中，置于23~27℃下无光照环境下诱导48h，不定芽成活率为52.4%，多倍体诱导率为20.8%，四倍体诱导率为18.7%。3、嵌合体分离培养：将诱导出的嵌合体，用无菌纸吸取表面诱导液，并用无菌水冲洗6~8次，吸干表面水分后，接种于MS+NAA0.05mg/L+KT2.0mg/L+BA2.0mg/L的分离培养基中，在温度23~27℃，光照强度2000~3000lux，单日光照时间10h环境下培养20天。4、四倍体筛选：分离培养的嵌合体，以本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用钩藤不定芽诱导四倍体植株的方法，其特征在于按以下步骤和方法进行：/n1）不定芽的无菌培养：选择健壮无病虫害钩藤幼嫩芽，经消毒后，接种于不定芽诱导培养基上，置于适宜环境下培养；/n2）多倍体诱导：将培养出的无菌不定芽剪成单芽，置于诱导液中，在适宜环境下诱导；/n3）嵌合体分离培养：将经诱导的嵌合体洗净后，置于分离培养基上，在适宜环境下培养；/n4）四倍体筛选：嵌合体分离培养成带茎叶植株后，根据形态学鉴定法，选叶片肥厚、茎增粗的嵌合体，以株为单位，取幼嫩叶，进行染色体鉴定；/n5）四倍体扩增：将筛选出的纯系四倍体，剪成单芽，接种于增殖培养基，在适宜环境下培养；/n6）四倍体生根：将获得的纯系四倍体苗，接种于生根培养基，在适宜环境下培养。/n

【技术特征摘要】
1.一种利用钩藤不定芽诱导四倍体植株的方法，其特征在于按以下步骤和方法进行：
1）不定芽的无菌培养：选择健壮无病虫害钩藤幼嫩芽，经消毒后，接种于不定芽诱导培养基上，置于适宜环境下培养；
2）多倍体诱导：将培养出的无菌不定芽剪成单芽，置于诱导液中，在适宜环境下诱导；
3）嵌合体分离培养：将经诱导的嵌合体洗净后，置于分离培养基上，在适宜环境下培养；
4）四倍体筛选：嵌合体分离培养成带茎叶植株后，根据形态学鉴定法，选叶片肥厚、茎增粗的嵌合体，以株为单位，取幼嫩叶，进行染色体鉴定；
5）四倍体扩增：将筛选出的纯系四倍体，剪成单芽，接种于增殖培养基，在适宜环境下培养；
6）四倍体生根：将获得的纯系四倍体苗，接种于生根培养基，在适宜环境下培养。


2.根据权利要求1所述的一种利用钩藤不定芽诱导四倍体植株的方法，其特征在于步骤1）所述的消毒方法依次为75%酒精15~20s，0.1%升汞溶液5~7min，不定芽诱导培养基为1/2MS+NAA0.1~0.5mg/L+BA3.0~5.0mg/L，培养环境为温度23~27℃，光照强度1000~2000lux，单日光照时间10h。


3.根据权利要求1所述的一种...

【专利技术属性】
技术研发人员：冷燕，
申请(专利权)人：临沧惠康中药材资源开发有限公司，
类型：发明
国别省市：云南;53