一种雪胆的组织培养及后期繁育的方法技术

本发明专利技术属于农业高新技术领域，具体涉及一种雪胆的组织培养及后期繁育的方法，包括以下步骤：初代培养基配制、外植体的消毒与处理、接种与培养、继代培养基的配制及接种、生根培养、炼苗、移栽。本发明专利技术的方法克服了现有技术实验室特定环境下培育的有效成分的损失，实现了野生品种的人工培育，经检测，运用本发明专利技术的方法繁育得到的雪胆中雪胆乙素、雪胆甲素、雪胆皂甙均有检出，其含量与野生雪胆的含量相当。本发明专利技术的方法提高雪胆幼苗的成苗率、缩短培育周期、保持野生雪胆的效用，在雪胆野生资源保存、保护、开发利用等方面具有应用前景。

A method of tissue culture and later breeding of snow gallbladder

【技术实现步骤摘要】
一种雪胆的组织培养及后期繁育的方法
本专利技术涉及一种组织培养方法，具体涉及一种雪胆的组织培养及后期繁育的方法，属于农业高新

技术介绍
雪胆为葫芦科雪胆属植物，该属植物据目前了解约有20多种，主要产于我国西南地区。其性味苦、性寒，传统药用使用量较少，野生资源较为丰富。但随着医学的发展，研究发现雪胆具有清热解毒，消炎止痛的功效。常用于胃痛，溃疡病，上呼吸道感染，支气管炎，肺炎，细菌性痢疾，肠炎，泌尿系感染，败血症及其他多种感染。近年来雪胆素片、雪胆胃肠丸、雪胆素胶囊、雪胆解毒丸等雪胆粗提物或复方制剂广泛用于临床，雪胆资源不断得到开发利用，野生资源遭到过度采挖，同时因雪胆分布区域狭窄，易受人为因素干扰，种群稳定性低，繁殖力不高，部分区域雪胆资源已濒临灭绝或完全绝种。现有技术人工繁殖雪胆的方法主要有藤蔓扦插、种子栽培、组织培养等。雪胆的组织培养是采用人工配置的培养液，在适宜的温度环境条件下，对雪胆进行快繁诱导，可缩短培育时间，但现有技术在快繁诱导过程中易造成雪胆种苗发生无性变异，且现有技术中的快繁培养基存在组织诱导率低、诱导苗质量差、多弱苗和幼苗增殖效率低、幼苗移栽成活率低等问题。
技术实现思路
为克服现有技术的不足，本专利技术提供了一种雪胆的组织培养及后期繁育的方法。其技术方案为：一种雪胆的组织培养及后期繁育的方法，具体包括以下步骤：（1）初代培养基配制：以基本培养基MS为基本培养基，分别添加不同剂量的6-BA、NAA，分别记为：A：MS+3%蔗糖+7%琼脂（对照）B：MS+3%蔗糖+7%琼脂+0.5mg/L6-BA+0.02mg/LNAAC：MS+3%蔗糖+7%琼脂+1.0mg/L6-BA+0.02mg/LNAAD：MS+3%蔗糖+7%琼脂+1.5mg/L6-BA+0.02mg/LNAA（2）外植体的消毒与处理：将雪胆顶部芽段放置于烧杯中，加适量洗洁精，自来水下冲洗1~2h，取出晾干并消毒，置无菌烧杯中用70%乙醇浸泡30s，无菌水冲洗3次，再用0.1%升汞液浸泡15min，轻摇，最后用无菌水冲洗3~4次，用无菌滤纸吸干备用；（3）接种与培养：将材料按照一芽一节切分，将形态学下端接种于上述步骤（1）所述的初代培养基中，每种培养基接种20瓶，每一瓶接种3个芽段，把接种好的材料置于光照培养箱中培养，接种30天以后，观察各材料在不同培养基中的生长情况，选择长势最好的配方中的植株作为继代培养材料；（4）继代培养基的配制及接种：将初代培养植株的茎段按照一节一叶进行切分，接种于微型扦插扩繁组：E：MS+3%蔗糖+7%琼脂+0.1mg/LIBAF：MS+3%蔗糖+7%琼脂+0.3mg/LIBAG：MS+3%蔗糖+7%琼脂+0.6mg/LIBA以及丛生芽扩繁组：H：MS+3%蔗糖+7%琼脂+0.5mg/L6-BAI：MS+3%蔗糖+7%琼脂+1.0mg/L6-BAJ：MS+3%蔗糖+7%琼脂+1.5mg/L6-BA培养条件为：温度26℃，每天光照16h，光照度为3000Lux，接种30天以后，观察各材料在不同培养基中的生长情况，选择扩繁率最好的配方中的植株作为后续继代培养材料，后续继代培养培养基选用第一次继代培养筛选出的最佳扩繁培养基，继代3次，每次周期为30天；（5）生根培养：扩繁后，进行生根培养，将以上扩繁获得的材料切为带有2-3个节段的材料，接种于生根培养基中：K：1/MS+3%蔗糖+7%琼脂+0.5mg/LNAAL：1/2MS+3%蔗糖+7%琼脂+1.0mg/LNAAM：1/2MS+3%蔗糖+7%琼脂+1.5mg/LNAA培养条件为：温度27℃，每天光照16h，光照度为3000Lux，接种30天以后，观察各材料在不同培养基中的生根情况，选择根系生长最好的配方中的植株作为后续炼苗移栽的材料；（6）炼苗：将培养瓶置于移栽温棚中一周以适应栽培环境光照和温度，一周后，微微打开瓶口2天，以适应栽培环境的气体环境，炼苗后，将材料置于清水中洗去根系中的培养基，用800倍的波尔多液对根系进行浸泡30min，以降低幼苗根系栽培期间的腐烂；（7）移栽：选取松林表层腐殖土作为基础基质，添加0.2倍体积的珍珠岩以及0.5倍体积的蛭石混匀后作为栽培基质，将基质铺设于苗床上，喷洒一次800倍多菌灵，第二天用小铲开出小沟，按照行株距15cm*10cm进行移栽，待苗根恢复生长后逐渐降低遮阴度，苗高至20cm时可移栽至种植田进行荫棚搭架栽培。进一步，所述步骤（3）中的培养条件为：温度26℃，每天光照16h，光照度为2000Lux。进一步，所述步骤（6）中移栽前，用遮阳网将移栽温棚的荫蔽度控制在0.6以上，温度控制在25-32℃。进一步，所述步骤（7）中栽培后保证环境湿度在60%以上。本专利技术的有益效果为：1、本专利技术的方法克服了现有技术实验室特定环境下培育的有效成分的损失，实现了野生品种的人工培育，经检测，运用本专利技术的方法繁育得到的雪胆中雪胆乙素、雪胆甲素、雪胆皂甙均有检出，其含量与野生雪胆的含量相当。2、本专利技术的方法提高雪胆幼苗的成苗率、缩短培育周期、保持野生雪胆的效用，在雪胆野生资源保存、保护、开发利用等方面具有应用前景。具体实施方式材料：雪胆外植体于2016年4月采集于临沧惠康中药种植基地，材料与冰块一同放置运输，品种为大果雪胆，选择顶部幼嫩茎段作为材料。实施例1一种雪胆的组织培养及后期繁育的方法，具体包括以下步骤：（1）初代培养基配制以基本培养基MS为基本培养基，分别添加不同剂量的6-BA、NAA。分别记为：①MS+3%蔗糖+7%琼脂（对照）②MS+3%蔗糖+7%琼脂+0.5mg/L6-BA+0.02mg/LNAA③MS+3%蔗糖+7%琼脂+1.0mg/L6-BA+0.02mg/LNAA④MS+3%蔗糖+7%琼脂+1.5mg/L6-BA+0.02mg/LNAA（2）外植体的消毒与处理将雪胆顶部芽段放置于烧杯中，加适量洗洁精，自来水下冲洗1h，取出晾干。处理好的材料在超净工作台进行消毒，置无菌烧杯中用70%乙醇浸泡30s，无菌水冲洗3次，再用0.1%升汞液浸泡15min，轻摇，最后用无菌水冲洗3次，用无菌滤纸吸干备用。（3）接种与培养将材料按照一芽一节切分，将形态学下端接种于以上初代培养基中，每种培养基接种20瓶，每一瓶接种3个芽段，把接种好的材料置于光照培养箱中培养。培养条件为：温度26℃，每天光照16h，光照度为2000Lux。接种30天以后，观察各材料在不同培养基中的生长情况，选择长势最好的配方中的植株作为继代培养材料。（4）继代培养基的配制及接种将初代培养植株的茎段按照一节一叶进行切分，接种于微型扦插扩繁组：⑤MS+3%蔗糖+7%琼脂+0.1mg/LIBA⑥MS+3%蔗糖+7%琼脂+0.3mg/LIBA⑦MS+3%蔗糖+7%琼脂+0.6mg/LIBA以及丛生芽扩繁组：⑧MS+3%蔗糖+7%琼脂+0.5mg/L6-BA⑨MS+3%蔗糖+7%琼脂+1.0mg/L6-BA⑩MS+3%蔗糖+7%琼脂+1.5mg/L6-BA培养条件为：温度26℃，每天光照16h，光照度为3000Lux。接种30天以后，观察各材料在不同培养基中的生长情况，选择扩繁率最好的配方中的植株作为后续继代培养材料，后续继代培养培养基选用第一次继代培养筛选出的最本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种雪胆的组织培养及后期繁育的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：（1）初代培养基配制：以基本培养基MS为基本培养基，分别添加不同剂量的6‑BA、NAA，分别记为：A：MS+3%蔗糖+7%琼脂B：MS+3%蔗糖+7%琼脂+0.5 mg/L 6‑BA+0.02mg/L NAAC：MS+3%蔗糖+7%琼脂+1.0 mg/L 6‑BA+0.02mg/L NAAD：MS+3%蔗糖+7%琼脂+1.5 mg/L 6‑BA+0.02mg/L NAA（2）外植体的消毒与处理：将雪胆顶部芽段放置于烧杯中，加适量洗洁精，自来水下冲洗1~2 h，取出晾干并消毒，置无菌烧杯中用70%乙醇浸泡30 s，无菌水冲洗3次，再用0.1%升汞液浸泡15min，轻摇，最后用无菌水冲洗3 ~ 4次，用无菌滤纸吸干备用；（3）接种与培养：将材料按照一芽一节切分，将形态学下端接种于上述步骤（1）所述的初代培养基中，每种培养基接种20瓶，每一瓶接种3个芽段，把接种好的材料置于光照培养箱中培养，接种30天以后，观察各材料在不同培养基中的生长情况，选择长势最好的配方中的植株作为继代培养材料；（4）继代培养基的配制及接种：将初代培养植株的茎段按照一节一叶进行切分，接种于微型扦插扩繁组：E：MS+3%蔗糖+7%琼脂+0.1mg/L IBAF：MS+3%蔗糖+7%琼脂+0.3mg/L IBAG：MS+3%蔗糖+7%琼脂+0.6mg/LIBA以及丛生芽扩繁组：H：MS+3%蔗糖+7%琼脂+0.5mg/L 6‑BAI：MS+3%蔗糖+7%琼脂+1.0mg/L 6‑BAJ：MS+3%蔗糖+7%琼脂+1.5mg/L 6‑BA培养条件为：温度26℃，每天光照16 h，光照度为3000 Lux，接种30天以后，观察各材料在不同培养基中的生长情况，选择扩繁率最好的配方中的植株作为后续继代培养材料，后续继代培养培养基选用第一次继代培养筛选出的最佳扩繁培养基，继代3次，每次周期为30天；（5）生根培养：扩繁后，进行生根培养，将以上扩繁获得的材料切为带有2‑3个节段的材料，接种于生根培养基中：K：1/MS+3%蔗糖+7%琼脂+0.5mg/L NAAL：1/2MS+3%蔗糖+7%琼脂+1.0mg/L NAAM：1/2MS+3%蔗糖+7%琼脂+1.5mg/L NAA培养条件为：温度27℃，每天光照16 h，光照度为3000 Lux，接种30天以后，观察各材料在不同培养基中的生根情况，选择根系生长最好的配方中的植株作为后续炼苗移栽的材料；（6）炼苗：将培养瓶置于移栽温棚中一周以适应栽培环境光照和温度，一周后，微微打开瓶口2天，以适应栽培环境的气体环境，炼苗后，将材料置于清水中洗去根系中的培养基，用800倍的波尔多液对根系进行浸泡30min，以降低幼苗根系栽培期间的腐烂；（7）移栽：选取松林表层腐殖土作为基础基质，添加0.2倍体积的珍珠岩以及0.5倍体积的蛭石混匀后作为栽培基质，将基质铺设于苗床上，喷洒一次800倍多菌灵，第二天用小铲开出小沟，按照行株距15cm*10cm进行移栽，待苗根恢复生长后逐渐降低遮阴度，苗高至20cm时可移栽至种植田进行荫棚搭架栽培。...

【技术特征摘要】
1.一种雪胆的组织培养及后期繁育的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：（1）初代培养基配制：以基本培养基MS为基本培养基，分别添加不同剂量的6-BA、NAA，分别记为：A：MS+3%蔗糖+7%琼脂B：MS+3%蔗糖+7%琼脂+0.5mg/L6-BA+0.02mg/LNAAC：MS+3%蔗糖+7%琼脂+1.0mg/L6-BA+0.02mg/LNAAD：MS+3%蔗糖+7%琼脂+1.5mg/L6-BA+0.02mg/LNAA（2）外植体的消毒与处理：将雪胆顶部芽段放置于烧杯中，加适量洗洁精，自来水下冲洗1~2h，取出晾干并消毒，置无菌烧杯中用70%乙醇浸泡30s，无菌水冲洗3次，再用0.1%升汞液浸泡15min，轻摇，最后用无菌水冲洗3~4次，用无菌滤纸吸干备用；（3）接种与培养：将材料按照一芽一节切分，将形态学下端接种于上述步骤（1）所述的初代培养基中，每种培养基接种20瓶，每一瓶接种3个芽段，把接种好的材料置于光照培养箱中培养，接种30天以后，观察各材料在不同培养基中的生长情况，选择长势最好的配方中的植株作为继代培养材料；（4）继代培养基的配制及接种：将初代培养植株的茎段按照一节一叶进行切分，接种于微型扦插扩繁组：E：MS+3%蔗糖+7%琼脂+0.1mg/LIBAF：MS+3%蔗糖+7%琼脂+0.3mg/LIBAG：MS+3%蔗糖+7%琼脂+0.6mg/LIBA以及丛生芽扩繁组：H：MS+3%蔗糖+7%琼脂+0.5mg/L6-BAI：MS+3%蔗糖+7%琼脂+1.0mg/L6-BAJ：MS+3%蔗糖+7%琼脂+1.5mg/L6-BA培养条件为：温度26℃，每天光照16h，光照度为3000Lux，接种30天以后，观察各材料在不同培养基中的生长情况，选择扩繁率最好的配方中的植株作为后续继...

【专利技术属性】
技术研发人员：林贵良，杨庆，
申请(专利权)人：临沧惠康中药材资源开发有限公司，
类型：发明
国别省市：云南,53