一种超高纯度硫酸乙酰肝素的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种超高纯度硫酸乙酰肝素的制备方法，该方法包括对肝素钠副产物进行溶解、沉淀，得到硫酸乙酰肝素粗品；然后对硫酸乙酰肝素粗品进行二次溶解、氧化、冷沉取上清液，再次沉淀，再溶解，吸附，洗脱，沉淀，最终获得超高纯度硫酸乙酰肝素。本发明专利技术方法克服了硫酸乙酰肝素和硫酸皮肤素、硫酸软骨素、肝素钠难以分离的难题，提高了硫酸乙酰肝素的收率和纯度，并且本发明专利技术方法操作简单，产品质量稳定，适合规模化生产。

A preparation method of ultra-high purity heparin sulfate

【技术实现步骤摘要】
一种超高纯度硫酸乙酰肝素的制备方法
本专利技术涉及生物医药
，更具体地说，尤其涉及一种超高纯度硫酸乙酰肝素的制备方法。
技术介绍
硫酸乙酰肝素是一种天然的糖胺聚糖，与肝素钠结构类似，但是硫酸乙酰肝素分子量较小，乙酰化程度高，硫酸基含量较少，抗凝活性缓和。硫酸乙酰肝素用于抗栓、抗炎、降血脂及糖尿病患者肾脏保护，是今年来研究最热的粘多糖类生化药物。硫酸乙酰肝素、肝素钠、硫酸皮肤素、硫酸软骨素这几种物质性质相似，采用传统的离子交换层析和有机溶剂分级沉淀方法难以将硫酸乙酰肝素纯化。中国专利ZL201510127522.2公开了一种精确定量控制肝素/类肝素中硫酸软骨素(CS)及硫酸皮肤素(DS)含量的方法，该方法步骤如下：(1)向含类肝素/肝素的溶液中加入具有硫酸软骨素酶B活性的蛋白质，待DS含量达到预期值时，终止酶解反应；(2)向溶液中继续加入具有硫酸软骨素酶AC活性的蛋白质，待CS含量达到预期值时，终止酶解反应，即得到期望CS及DS含量的肝素样品或类肝素样品。而硫酸乙酰肝素是粗肝素经过乙醇沉淀、阴离子交换层析后得到的一种肝素衍生物。尽管上述专利技术中能够精确定量控制硫酸软骨素和硫酸皮肤素的含量，但是无法实现类肝素中硫酸乙酰肝素和硫酸皮肤素的分离或者精确定量控制。中国专利ZL201610010556.8公开了一种从十二指肠中提取硫酸乙酰肝素的方法，该方法以生物酶与酸碱处理方法相结合，经过猪十二指肠→绞碎→酶解→加热→离心→树脂吸附→洗脱→沉淀→碱加热→酸处理→低倍沉淀→氧化→沉淀→真空干燥得到硫酸乙酰肝素。该专利方法实质上是去除十二指肠的油脂、酸性蛋白质、碱性蛋白质和核酸后得到硫酸乙酰肝素，但因为其它种类的糖胺聚糖(比如硫酸皮肤素)也会被树脂吸附，并在直接的氯化钠浓度下洗脱，从而导致糖胺聚糖与硫酸乙酰肝素混杂在一起。虽然后续步骤使用了调酸离心方法来去除硫酸皮肤素，但该方法会有硫酸皮肤素残留在上清液，因此硫酸乙酰肝素始终伴随有硫酸皮肤素，故得到的硫酸乙酰肝素纯度不高。中国专利ZL201510394022.5公开了一种从肝素副产物废蛋白中分离类肝素的方法，该方法将肝素副产物废蛋白溶解，加吸附剂，洗脱醇沉，氧化醇沉烘干，得到类肝素干品，但该类肝素干品不仅含有硫酸乙酰肝素、至少还含有抗凝活性较高的快肝素等粘多糖，说明类肝素干品中硫酸乙酰肝素纯度不高。中国专利ZL200910039359.9公开了一种从肝素副产物纯化硫酸乙酰肝素的方法，该方法以肝素副产物为原料，溶解后加入醋酸钾，通过醋酸调节溶液的pH值，去沉淀后得到硫酸多糖溶液，向硫酸多糖溶液加入斑氏试剂和饱和氢氧化钠溶液、离心、收集清液，沉淀中再加入斑氏试剂和饱和氢氧化钠溶液、离心、收集清液，清液合并，上一根阴离子交换性质的层析柱，以氯化钠溶液洗去铜离子，再以氯化钠溶液线性梯度洗脱，收集洗脱液，将洗脱液蒸发浓缩以乙醇沉淀得到高纯度的硫酸乙酰肝素。该专利技术使用了含铜的斑氏试剂，工艺不环保，且后续还需要除铜，流程复杂，且除铜效果如何不得而知。中国专利ZL201210424451.9公开了一种从肝素副产物中分离提纯肝素钠和硫酸乙酰肝素的方法，该方法包括将原料肝素副产物溶解后加入醋酸钾使肝素钠沉淀分离，沉淀溶解后再加入醋酸钾沉淀，收集沉淀，溶解后经过无水乙醇多次分级沉淀，进而制得纯度较高的肝素钠；上清液通过加入班氏试剂和饱和氢氧化钠溶液，离心得到含有硫酸乙酰肝素的溶液，以除铜剂除去铜离子，加入活性炭吸附沉淀并脱色后过滤，再通过阴离子交换树脂吸附和洗脱，分离得到高纯度的硫酸乙酰肝素。该专利技术使用了含铜的斑氏试剂，工艺不环保，且后续还需要除铜，流程复杂。中国专利ZL200610040707.0公开了一种肝素钠副产物中分离提纯硫酸皮肤素和低分子硫酸乙酰肝素的方法，该方法涉及一种从肝素钠副产物中分离提纯硫酸皮肤素和低分子硫酸乙酰肝素的方法，以生产肝素钠的副产物为原料，该原料是含有硫酸皮肤素和硫酸乙酰肝素的混合物，原料通过乙醇分级沉淀，得到硫酸皮肤素粗品；然后采用亚硝酸盐或亚硝酸酯类化合物为氧化剂，使该粗品中含有的硫酸乙酰肝素被降解成高溶解度的低分子硫酸乙酰肝素，再通过乙醇分级沉淀分离得到高纯度的硫酸皮肤素和低分子硫酸乙酰肝素。该专利技术得到的硫酸乙酰肝素是经过降解得到的低分子硫酸乙酰肝素，与通常意义上的硫酸乙酰肝素有较大不同。中国专利ZL201410274835.6公开了一种乙醇沉淀法从肝素副产物制备舒洛地特原料的方法，该方法将肝素副产物溶解，以氢氧化钠调节溶液至高pH值，以适量乙醇做低温沉淀，去沉淀后得到硫酸多糖溶液；以盐酸调该硫酸多糖溶液至低pH值，以适量乙醇做低温沉淀，去沉淀后得到硫酸多糖溶液；再以氢氧化钠调节该溶液至pH中性，以适量乙醇做室温沉淀，取沉淀烘干得到制得的舒洛地特原料。该专利技术得到的舒落地特原料含有硫酸皮肤素和快肝素或硫酸乙酰肝素，因此，硫酸乙酰肝素纯度不高。中国专利申请201710220707.7公开了一种羊肝素钠粗品提取废液制备硫酸乙酰肝素的方法，该方法采用对羊肝素钠粗品提取废液进行稀释、吸附、洗涤、洗脱、沉淀、干燥得到硫酸乙酰肝素。该专利方法通过树脂吸附洗脱得到硫酸乙酰肝素的同时，也混杂了硫酸皮肤素等糖胺聚糖，因此硫酸乙酰肝素的纯度不高。中国专利申请201410819670.6公开了一种从动物肺脏中分离硫酸乙酰肝素的方法，该方法选用水解酶对动物肺脏的盐水提取物进行组合酶降解，随后在酶解液中加入氧化剂和活性炭进行氧化吸附脱色，然后采用丙酮对氧化后的溶液分级沉淀，并脱水干燥制得硫酸乙酰肝素粗品，然后对粗品硫酸乙酰肝素的水溶液依次采用膜分离和阴离子交换层析，将硫酸乙酰肝素与硫酸皮肤素、硫酸软骨素、肝素等杂质分离，再使用5000-7000Da的超滤膜对洗脱液进行超滤浓缩，最后使用凝胶过滤层析脱盐并冻干，得硫酸乙酰肝素精品，但该专利技术工艺流程冗长，需要繁杂的中间过程控制，且工艺条件不易放大，工业化前景堪忧。中国专利申请200610044491.5公开了一种来源于鼠组织的硫酸乙酰肝素及其制备方法，该方法将鼠组织绞碎均质后，脱脂，用蛋白酶水解，再用碱水解，脱蛋白，离心取清液，透析，透析液用氯化十六烷基吡啶沉淀，用核糖核酸酶和硫酸软骨素酶ABC水解，再用离子交换柱分离，该方法得到的硫酸乙酰肝素抗凝活性强。但是，硫酸乙酰肝素的纯度越高，抗凝活性越低，故该专利得到的硫酸乙酰肝素纯度不高。并且该方法还存在原料来源和产品安全性方面的问题。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种超高纯度硫酸乙酰肝素的制备方法，克服硫酸乙酰肝素和硫酸皮肤素、硫酸软骨素、肝素钠难以分离的难题，提高硫酸乙酰肝素的收率和纯度。本专利技术的目的通过如下技术方案来实现：一种超高纯度硫酸乙酰肝素的制备方法，包括以下步骤：(1)一次溶解：向肝素钠副产物中加入浓度2％的盐水，溶解成5％-15％的溶液；(2)一次沉淀：向(1)中溶液加入0.5-1.1倍体积的95％乙醇，在40℃沉淀3-5h；(3)二次溶解：去除上清液，向(2)中沉淀物加入浓度2本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种超高纯度硫酸乙酰肝素的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：/n（1）一次溶解：向肝素钠副产物中加入浓度2%的盐水，溶解成5%-15%的溶液；/n（2）一次沉淀：向（1）中溶液加入0.5-1.1倍体积的95%乙醇，在40℃沉淀3-5h；/n（3）二次溶解：去除上清液，向（2）中沉淀物加入浓度2%的盐水，溶解成5%-15%的溶液；/n（4）氧化：用4M氢氧化钠溶液调（3）中溶液pH至11.0，加入总体积2%的过氧化氢溶液，室温氧化4-8h；/n（5）二次沉淀：用盐酸调（4）中溶液pH至6.0-7.0，加入0.4-0.6倍体积的95%乙醇，在5℃沉淀16-24h，收集上清液；/n（6）三次沉淀：向（5）中上清液加入1.0-2.0倍体积的95%乙醇，室温沉淀3-5h；/n（7）三次溶解：去除上清液，向（6）中沉淀物加水溶解成1%-9%的溶液；/n（8）吸附：将（7）中溶液转移到大孔吸附树脂柱中，室温吸附1-2h；/n（9）洗脱：用浓度2%-8%的盐水洗涤树脂，收集洗涤液；/n（10）四次沉淀：向（9）中洗涤液加入1.0-2.0倍体积的95%乙醇，室温沉淀8-16h，将沉淀物干燥，即得超高纯度硫酸乙酰肝素。/n...

【技术特征摘要】
1.一种超高纯度硫酸乙酰肝素的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）一次溶解：向肝素钠副产物中加入浓度2%的盐水，溶解成5%-15%的溶液；
（2）一次沉淀：向（1）中溶液加入0.5-1.1倍体积的95%乙醇，在40℃沉淀3-5h；
（3）二次溶解：去除上清液，向（2）中沉淀物加入浓度2%的盐水，溶解成5%-15%的溶液；
（4）氧化：用4M氢氧化钠溶液调（3）中溶液pH至11.0，加入总体积2%的过氧化氢溶液，室温氧化4-8h；
（5）二次沉淀：用盐酸调（4）中溶液pH至6.0-7.0，加入0.4-0.6倍体积的95%乙醇，在5℃沉淀16-24h，收集上清液；
（6）三次沉淀：向（5）中上清液加入1.0-2.0倍体积的95%乙醇，室温沉淀3-5h；
（7）三次溶解：去除上清液，向（6）中沉淀物加水溶解成1%-9%的溶...

【专利技术属性】
技术研发人员：干浩，董凯，韩自江，陈新伟，付志豪，周伟，
申请(专利权)人：湖北亿诺瑞生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42