抗CTLA-4纳米抗体及其在肿瘤治疗中的应用制造技术

本发明专利技术涉及一种抗CTLA‑4纳米抗体及其应用。所提供的抗CTLA‑4纳米抗体选自下列至少之一：(1)具有GYRYSPYC所示的CDR1、IDSDGST所示的CDR2和AADPASFGDCYSGSWSPETI所示的CDR3；(2)与(1)相比，具有至少一个保守氨基酸取代。所提供的抗CTLA‑4纳米抗体与CTLA‑4胞外段的结合能力强，可以用于肿瘤的诊断和治疗。

Anti-CTLA-4 nano antibody and its application in tumor therapy

【技术实现步骤摘要】
抗CTLA-4纳米抗体及其在肿瘤治疗中的应用
本专利技术涉及医药生物学和生物制药
，具体涉及一种抗CTLA-4纳米抗体及其应用。
技术介绍
免疫检查点(immunecheckpoint)在机体的特异性免疫过程中，主要调节T细胞介导的免疫反应。机体受到肿瘤侵袭时，肿瘤细胞通过异常上调抑制性共刺激分子及其配体表达，抑制T细胞发挥功能，有利于肿瘤细胞的生长和逃逸。细胞毒T淋巴细胞相关抗原4(cytotoxicTlymphocyte-associatedantigen-4,CTLA-4)是一种白细胞分化抗原，是T细胞上的一种跨膜抑制性共受体。CTLA-4与T细胞刺激协同B7家族分子结合后诱导T细胞无反应性，参与免疫反应的负调节。而且CTLA-4也在调节性T细胞(Tregs)中发现并有助于它们的抑制功能。CTLA-4的配体在许多实体瘤中存在高度表达的水平。当这些配体与T细胞上的CTLA-4结合后下调T细胞的免疫应答，从而使得肿瘤细胞逃逸免疫系统的识别和杀伤作用。因此CTLA-4是肿瘤免疫治疗的重要靶点。目前多使用抗CTLA-4抗体用于肿瘤治疗，这些抗体都是传统的抗体分子，分子量大，需要在动物细胞中进行表达生产。因而具有生产成本高，在体内可能会导致免疫原性等缺点。小分子纳米抗体由于具有分子质量小，体积小，无Fc段等性质，使它们在很多方面的表现优于传统抗体，免疫原性低，它们不易产生自身免疫反应；有很强的组织渗透性；易于结合隐蔽的抗原表位；可用微生物进行生产，且生产成本低等优势。然后抗CTLA-4纳米抗体还需要进一步改进。
技术实现思路
本专利技术旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本专利技术的一个目的在于提出一种抗CTL-4纳米抗体及其应用。我们抽取骆驼外周血构建噬菌体文库，从中筛选获得抗CTLA-4纳米抗体，并将其在大肠杆菌和酵母中进行表达。所获得的抗CTLA-4纳米抗体分子量小，特异性强，与CTLA-4胞外段的结合能力强，因而可以用于CTLA-4高表达的肿瘤的诊断和治疗。为此，本专利技术提供了如下技术方案：在本专利技术的第一方面，本专利技术提供了一种抗CTLA-4纳米抗体，所述纳米抗体选自下列至少之一：(1)具有GYRYSPYC所示的CDR1、IDSDGST所示的CDR2和AADPASFGDCYSGSWSPETI所示的CDR3；(2)与(1)相比，具有至少一个保守氨基酸取代。所提供的抗CTLA-4纳米抗体分子量小，特异性强，与CTLA-4胞外段的结合能力强，可以用于肿瘤的诊断和治疗，尤其是用于CTLA-4高表达的肿瘤的诊断和治疗。根据本专利技术的实施例，以上所述的纳米抗体具有如下所示的氨基酸序列：(a)SEQIDNO:1所示的氨基酸序列；(b)与(a)相比，具有至少一个保守氨基酸取代。在本专利技术的第二方面，本专利技术提供了一种核酸，所述核酸包含编码本专利技术第一方面所述的纳米抗体的核酸序列。根据本专利技术的实施例，以上所述的核酸还可以进一步包括如下技术特征：根据本专利技术的实施例，所述核酸包含如下所示的核酸序列：SEQIDNO:2所示的核酸序列；与SEQIDNO:2所示的核酸序列相比，至少具有95％以上同源性的序列，优选具有98％以上同源性的序列，更优选具有99％以上同源性的序列。在本专利技术的第三方面，本专利技术提供了一种表达载体，所述表达载体包含本专利技术第二方面所述的核酸。根据本专利技术的实施例，所述表达载体进一步包含调节元件，所述调节元件与所述核酸可操作地连接。根据本专利技术的实施例，所述调节元件包括选自启动子、增强子和终止子中的至少一种。在本专利技术的第四方面，本专利技术提供了一种重组细胞，所述重组细胞含有本专利技术第三方面所述的表达载体。在本专利技术的第五方面，本专利技术提供了一种生产抗CTLA-4纳米抗体的方法，包括培养本专利技术第四方面所述的重组细胞，以便获得所述抗CTLA-4纳米抗体。在本专利技术的第六方面，本专利技术提供了一种纳米抗体在制备治疗肿瘤中的用途，所述纳米抗体为本专利技术第一方面所述的纳米抗体。根据本专利技术的实施例，所述肿瘤包括选自前列腺癌，恶性黑素瘤和肺癌中的至少一种。根据本专利技术的实施例，所述肺癌包括小细胞肺癌和非小细胞肺癌。在本专利技术的第七方面，本专利技术提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括本专利技术第一方面所述的纳米抗体和药学上可接受的载体。在本专利技术的第八方面，本专利技术提供了一种检测CTLA-4的试剂盒，所述试剂盒包含本专利技术第一方面所述的纳米抗体。在本专利技术的第九方面，本专利技术提供了一种Car-T细胞，所述Car-T细胞包括本专利技术第一方面所述的纳米抗体。应用所提供的含有抗CTLA-4纳米抗体的Car-T细胞对病人进行细胞回输，可以用来治疗肿瘤。附图说明图1是根据本专利技术的实施例提供的经过三轮淘洗的菌落图。图2是根据本专利技术的实施例提供的三种抗CTLA-4纳米抗体的表达纯化结果。图3是根据本专利技术的实施例提供的三种抗CTLA-4纳米抗体的特异性检测结果。图4是根据本专利技术的实施例提供的三种抗CTLA-4纳米抗体的热稳定性检测结果。图5是根据本专利技术的实施例提供的三种抗CTLA-4纳米抗体与人恶性黑色素瘤细胞A375细胞上CTLA-4结合效率的检测结果图。具体实施方式下面详细描述本专利技术的实施例，需要说明的是，所描述述的实施例是示例性的，旨在用于解释本专利技术，而不能理解为对本专利技术的限制。同时，为了方便本领域技术人员的理解，对于本文中的一些术语进行了解释和说明。这些解释和说明仅用于方便理解，而不应看做是对本专利技术保护范围的限制。在本文中，术语“抗体”是指能够与特异性抗原结合的免疫球蛋白分子。通常抗体结构包括两条分子量较轻的轻链和两条分子量较重的重链，重链(H链)和轻链(L链)由二硫键连接形成一个四肽链分子。其中，肽链的氨基端(N端)氨基酸序列变化很大，称为可变区(V区)，可变区决定抗体的识别以及与抗原的特异性结合；羧基端(C端)相对稳定，变化很小，称为恒定区(C区)，恒定区通常赋予重要的生物学特性，例如抗体链结合、分泌、经胎盘移动性、补体结合和Fc受体结合。重链和轻链的可变区通常称为VH和VL。在可变区中某些区域氨基酸组成和排列顺序具有更高的变化程度，称为高变区(Hypervariableregion，HVR)，高变区为抗原和抗体结合的位置，因此也称为决定簇互补区(complementarity-determiningregion，CDR)。重链可变区和轻链可变区上均有三个CDR区。为了表述上的方便，位于重链上的CDR区也称为重链高变区，位于轻链上的CDR区也称为轻链高变区。肽链可变区内除了高变区之外的氨基酸组成和排列顺序变化相对较小，称为骨架区(FR)。VH和VL内各有4个骨架区，分别以FR1、FR2、FR3和FR4表示。纳米抗体(nanobody，asingledomainantibody)，也称VHH(Variabledomainofhea本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抗CTLA-4纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体选自下列至少之一：/n(1)具有GYRYSPYC所示的CDR1、IDSDGST所示的CDR2和AADPASFGDCYSGSWSPETI所示的CDR3；/n(2)与(1)相比，具有至少一个保守氨基酸取代。/n

【技术特征摘要】
1.一种抗CTLA-4纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体选自下列至少之一：
(1)具有GYRYSPYC所示的CDR1、IDSDGST所示的CDR2和AADPASFGDCYSGSWSPETI所示的CDR3；
(2)与(1)相比，具有至少一个保守氨基酸取代。


2.根据权利要求1所述的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体具有如下所示的氨基酸序列：
(a)SEQIDNO:1所示的氨基酸序列；
(b)与(a)相比，具有至少一个保守氨基酸取代。


3.一种核酸，其特征在于，所述核酸包含编码权利要求1所述的纳米抗体的核酸序列；
任选地，所述核酸包含如下所示的核酸序列：
SEQIDNO:2所示的核酸序列；
与SEQIDNO:2所示的核酸序列相比，至少具有95％以上同源性的序列，优选具有98％以上同源性的序列，更优选具有99％以上同源性的序列。


4.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包含权利要求3所述的核酸；
任选地，进...

【专利技术属性】
技术研发人员：熊盛，谢秋玲，沈潇，韩玥，
申请(专利权)人：佛山汉腾生物科技有限公司，暨南大学，
类型：发明
国别省市：广东;44