一种河豚毒素成分分析标准物质的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种河豚毒素成分分析标准物质的制备方法，以河豚鱼为样本，经清洗、去杂、均质、定量混合、冻干、粉碎、过筛、分装、辐照、保藏等工艺，制得候选标准物质。对分装好的标准物质，进行最小取样量、均匀性、稳定性检验，确保其满足国家标准物质特性的需求。本发明专利技术的制备方法，可更好地保留基质中的原有成分，且具有较好的均匀性、稳定性、复水性以及更长的保质期，填补了国内外河豚毒素基质标准物质的空白；本发明专利技术的基质标准物质可有效评价相关实验室的河豚毒素检测能力和水平，可用于河豚毒素定性定量分析的质量控制，确保水产品中河豚毒素检测的准确性，为食品安全保驾护航。

A preparation method of tetrodotoxin component analysis reference material

【技术实现步骤摘要】
一种河豚毒素成分分析标准物质的制备方法
本专利技术属于计量
，具体涉及一种河豚毒素成分分析标准物质的制备方法。
技术介绍
河豚毒素（tetrodotoxin,TTX）是鲀鱼类（俗称河豚鱼）及其它生物体内含有的一种生物碱，其分子式为C11H17O8N3，为氨基全氢喹唑啉型化合物，是自然界中所发现的毒性最大的神经毒素之一，其毒性比氰化物还要高1250多倍，0.5mg即可致人于死命。长期以来，国内外学者对河豚毒素的起源进行了一系列研究。目前，多数专家学者认为，TTX的真正来源不是动物本身,而是通过食物链聚集或由其共生的微生物产生。人工饲养时，通过把握水源与投喂的饲料，改变河豚的食物链，能有效控制河豚毒素的产生，但对于人工养殖的河豚鱼也需要严格监控其毒素含量，确保食用安全。随着河豚毒素的毒理、形态以及代谢分析的深入，水产品中河豚毒素必将是食品安全检测关注的重点内容，与之配套的检测技术需要进一步成熟并成体系，河豚毒素相关的基质标准物质的需求更加迫切。截止目前，查阅文献与国际权威标准物质数据库（例如国际标准物质数据库COMAR、欧盟标准物质数据库IRMM和ERM、美国NationalInstituteofStandardsandTechnology(NIST)、加拿大NationalResearchCouncilofCanada(NRCC)等），世界各国食品基质生物毒素类标准物质均不包括河豚毒素基质标准物质。
技术实现思路
本专利技术的目的之一在于提供一种河豚毒素成分分析标准物质的制备方法，填补国内外河豚毒素基质标准物质的空白，且制备的标准物质具有良好的均匀性和稳定性。为达到上述目的，本专利技术采用的具体技术方案如下：一种河豚毒素成分分析标准物质的制备方法，包括以下步骤：S1.样本采集：采集野生河豚鱼作为基质标准物质的阳性样本，养殖的河豚鱼作为阴性样本；S2.样本处理：分别将阳性样本和阴性样本分解出肌肉、肝脏，称量后将组织剪碎，充分均质；S3.候选物制备：①利用液相色谱-串联质谱法，对阳性、阴性样本中的河豚毒素含量进行测定，然后按照预设的标准物质总质量、毒素含量，计算出阳性样本、阴性样本混合所需的质量，按计算值混合阳性样本和阴性样本；②将混合样本搅拌混匀，再进行冷冻干燥；③将干燥后的块状样本粉碎过筛，得到河豚毒素成分分析候选物；S4.候选物的分装、保藏：将得到的候选物混匀，然后随机抽取至少10份小样，进行均匀性初筛，如果测得小样的河豚毒素含量的RSD≤5%，则可作为河豚毒素成分分析标准物质进行样本分装，否则继续延长混匀时间；样本分装密封，经Co-60γ射线照射灭菌后，在-20～-80℃冷冻保存。S5.性能评估：对步骤S4制备的候选物，进行最小取样量、均匀性、稳定性检验。本专利技术所述的河豚毒素成分分析标准物质的制备方法选取野生河豚鱼和养殖河豚鱼分别作为阳性样本和阴性样本，并选择河豚鱼的肝脏、肌肉作为基体，通过阳性样本和阴性样本的混合获得所述毒素含量的标准物质，因此本专利技术的标准物质基质全部来自于河豚鱼，无任何添加物，避免了其应用时杂质的干扰，可更好的保留基质中的原有成分，提高了检测的准确性，还对制得的标准物质进行最小取样量、均匀性、稳定性检验来评价标准物质的质量，满足一级标准物质技术规范（JJG1006-94）的要求，因此本专利技术的制备方法科学、可靠。优选的，步骤S5中最小取样量和均匀性采用F检验进行分析；稳定性包括25℃短期稳定性和4℃长期稳定性。进一步的，分别对均匀性和稳定性的检验结果合成标准物质定值不确定度。优选的，步骤S3中冷冻干燥的具体过程和工艺参数如下：预冻温度-25～-30℃，预冻时间1h；升华干燥设定为两个阶段，第一阶段升华温度设定为-15～-25℃，升华时间10～15h，第二阶段升华温度设定为-4～-8℃，升华时间10～15h；解析干燥温度设定为10～20℃，解析干燥时间5～10h。通过预冻-两阶段升华-解析干燥过程确保混合样本脱水完全，避免后期储存过程快速变质，提高稳定性，延长保质期。进一步的，冷冻干燥前需要将混匀的组织样本平铺，平铺厚度在1～4cm。将混合样本平铺后进行预冻-两阶段升华-解析干燥处理，并控制平铺厚度，降低样本内部脱水难度，确保脱水完全的同时有效加快了脱水速度。优选的，步骤S3混合样本混匀过程采用旋转搅拌机连续搅拌至少2h；步骤S4候选物混匀过程采用三维混匀机至少混匀12h。严格控制混匀时间，确保混匀效果良好，提高标准物质的均匀性。优选的，步骤S3中过筛目数为75～100目，提升样本均质化程度，进而提高成品质量。优选的，所述步骤S4中样本分装密封后经Co-60γ射线照射灭菌再进行冷冻保存。本专利技术的目的之二在于提供由上述方法制备的河河豚毒素成分分析标准物质。本专利技术的目的之三在于提供所述河豚毒素成分分析标准物质的用途，包括水产品中河豚毒素检测方法的验证，以及实验室间对河豚毒素检测能力和水平的考核。本专利技术的有益效果如下：本专利技术的河豚毒素成分分析标准物质和制备方法，填补了国内外河豚毒素基质标准物质的空白，响应了国务院印发的《计量发展规划（2013-2020年）》，且制备方法简单、可靠，得到的样品具有较好的均匀性、稳定性、复水性以及更长的保质期。本专利技术的标准物质可有效评价相关实验室的河豚毒素检测能力和水平，可用于河豚毒素定性定量分析的质量控制，确保水产品中河豚毒素检测的准确性，为食品安全保驾护航。具体实施方式以下结合具体实施例对本专利技术进行进一步的说明。实施例11材料与方法1.1仪器、试剂仪器：AquityH超高压液相色谱仪美国沃特世有限责任公司；WatersTQD三重四级杆串联质谱仪美国沃特世有限责任公司；Milli-Q超纯仪美国Millipore公司；涡旋振荡器德国海道夫有限公司；高速冷冻离心机德国Sigma公司；1ml移液枪德国brand公司试剂：河豚毒素纯标准物质西班牙LaboratorioCIFGAS.A.；免疫亲和净化柱江苏美正生物科技有限公司；乙腈、甲醇（均为色谱纯）德国Merck；甲酸、乙酸、甲酸铵（均为色谱纯），0.22μm尼龙针式滤膜上海安普实验科技股份有限公司；超纯水（Millipore纯水仪制备）；50mL离心管美国康宁公司。1.2河豚毒素含量测定方法依据标准：GB5009.206—2016水产品中河豚毒素的测定液相色谱-串联质谱法；方法原理：样本经1%乙酸-甲醇溶液提取，免疫亲和柱净化，液相色谱-串联质谱法测定，外标法定；前处理过程：准确称取0.4g样品（精确到0.001g）加入1.6ml水复溶，在加20ml1%乙酸-甲醇溶液，涡旋振荡15min，8000r/min离心5min，准确移取1mL上清液，加入10mLPBS溶液进行稀释，用氢氧化钠溶液（1mol/L）调pH在7～8范围内，待净化；将免疫亲和柱中封存的PBS溶液以本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种河豚毒素成分分析标准物质的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：/nS1. 样本采集：采集野生河豚鱼作为基质标准物质的阳性样本，养殖的河豚鱼作为阴性样本；/nS2. 样本处理：分别将阳性样本和阴性样本分解出肌肉、肝脏，称量后将组织剪碎，充分均质；/nS3. 候选物制备：/n① 利用液相色谱-串联质谱法，对阳性、阴性样本中的河豚毒素含量进行测定，然后按照预设的标准物质总质量、毒素含量，计算出阳性样本、阴性样本混合所需的质量，按计算值混合阳性样本和阴性样本；/n② 将混合样本搅拌混匀，再进行冷冻干燥；/n③ 将干燥后的块状样本粉碎过筛，得到河豚毒素成分分析候选物；/nS4. 标准物质制备：将得到的候选物混匀，然后随机抽取至少10份小样，进行均匀性初筛，如果测得小样的河豚毒素含量的RSD≤5%，则可作为河豚毒素成分分析标准物质进行样本分装，否则继续延长混匀时间；样本分装密封，在-20～-80℃冷冻保存，/nS5. 性能评估：对步骤S4制备的标准物质，进行最小取样量、均匀性、稳定性检验。/n

【技术特征摘要】
1.一种河豚毒素成分分析标准物质的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1.样本采集：采集野生河豚鱼作为基质标准物质的阳性样本，养殖的河豚鱼作为阴性样本；
S2.样本处理：分别将阳性样本和阴性样本分解出肌肉、肝脏，称量后将组织剪碎，充分均质；
S3.候选物制备：
①利用液相色谱-串联质谱法，对阳性、阴性样本中的河豚毒素含量进行测定，然后按照预设的标准物质总质量、毒素含量，计算出阳性样本、阴性样本混合所需的质量，按计算值混合阳性样本和阴性样本；
②将混合样本搅拌混匀，再进行冷冻干燥；
③将干燥后的块状样本粉碎过筛，得到河豚毒素成分分析候选物；
S4.标准物质制备：将得到的候选物混匀，然后随机抽取至少10份小样，进行均匀性初筛，如果测得小样的河豚毒素含量的RSD≤5%，则可作为河豚毒素成分分析标准物质进行样本分装，否则继续延长混匀时间；样本分装密封，在-20～-80℃冷冻保存，
S5.性能评估：对步骤S4制备的标准物质，进行最小取样量、均匀性、稳定性检验。


2.根据权利要求1所述的河豚毒素成分分析标准物质的制备方法，其特征在于：步骤S5中最小取样量和均匀性采用F检验进行分析；稳定性包括25℃短期稳定性和4℃长期稳定性。


3.根据权利要求2所述的河豚毒素成分分析标准物质的制备方法，其特征在于：分别对均匀性和稳定性的检验结果合成标准物质定值不确定度。

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【专利技术属性】
技术研发人员：王兴龙，任一平，蔡强，诸寅，杨大进，许娇娇，
申请(专利权)人：浙江清华长三角研究院，
类型：发明
国别省市：浙江;33