一种肿瘤突变负荷标准品及其制备方法和试剂盒技术

本发明专利技术提供一种肿瘤突变负荷标准品及其制备方法和应用，以6对配对细胞系提取的基因组DNA按照一定比例混合而成，并通过全外显子测序对梯度参考品进行测序，经过特定的生物信息算法计算出相应梯度参考品的肿瘤突变负荷值；而检测限参考品则通过使用配对样品中的正常细胞样品稀释肿瘤细胞样品，并使用微滴式数字PCR的方法验证稀释比例，确保混合符合预期，以此最大程度模拟临床样品的复杂性及检验检测系统的特异及灵敏性；本产品可以用于肿瘤突变负荷检测产品的性能评价，也可以用于肿瘤突变负荷的算法优化或检测流程优化。适用于高通量中的全外显子、靶向基因组或外显子组子集的测序策略。

A tumor mutation load standard and its preparation and kit

【技术实现步骤摘要】
一种肿瘤突变负荷标准品及其制备方法和试剂盒
本专利技术涉及肿瘤基因突变检测领域，具体涉及一种肿瘤突变负荷（TumorMutationBurden，TMB）标准品及其制备方法和试剂盒。
技术介绍
近年来，受国家政策的大力推动和技术的不断更替，分子诊断尤其是基因检测领域发展极为迅速，基因检测涉及无创产前检测，肿瘤易感预测，肿瘤早期诊断，个体化用药，术后监测以及消费型基因检测等。由于市场容量巨大，近年来，市场上出现了越来越多的此类基因检测的试剂盒。而肿瘤突变负荷（TumorMutationBurden，TMB）作为一个潜在的生物标志物而出现，业内公司也争相推出相关检测。如何测准肿瘤突变负荷也是一直困扰相关检测行业的一大难题。TMB定义为一份肿瘤样本中，所评估基因的外显子编码区每兆碱基中发生置换和插入/缺失突变的总数。在不同的癌症中体细胞突变的数量从0.01突变/Mb~超过400突变/Mb不等。而这些突变中有些会转录表达多肽抗原表位或肿瘤新抗原。早期关于TMB的研究都是采用全外显子测序（WES）方法对肿瘤DNA和对照的胚系DNA进行分析。201本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种肿瘤突变负荷检测的标准品，其特征在于，所述标准品包括以下六对配对细胞系的基因组DNA：/n细胞系编号GW-P1-T：细胞系名称NCI-H1770；/n细胞系编号GW-P1-N：细胞系名称NCI-BL1770；/n细胞系编号GW-P2-T：细胞系名称NCI-H1184；/n细胞系编号GW-P2-N：细胞系名称NCI-BL1184；/n细胞系编号GW-P3-T：细胞系名称NCI-H128；/n细胞系编号GW-P3-N：细胞系名称NCI-BL128；/n细胞系编号GW-P4-T：细胞系名称NCI-H2171；/n细胞系编号GW-P4-N：细胞系名称NCI-BL2171；/n细胞系编号GW-P...

【技术特征摘要】
1.一种肿瘤突变负荷检测的标准品，其特征在于，所述标准品包括以下六对配对细胞系的基因组DNA：
细胞系编号GW-P1-T：细胞系名称NCI-H1770；
细胞系编号GW-P1-N：细胞系名称NCI-BL1770；
细胞系编号GW-P2-T：细胞系名称NCI-H1184；
细胞系编号GW-P2-N：细胞系名称NCI-BL1184；
细胞系编号GW-P3-T：细胞系名称NCI-H128；
细胞系编号GW-P3-N：细胞系名称NCI-BL128；
细胞系编号GW-P4-T：细胞系名称NCI-H2171；
细胞系编号GW-P4-N：细胞系名称NCI-BL2171；
细胞系编号GW-P5-T：细胞系名称COLO829；
细胞系编号GW-P5-N：细胞系名称COLO829BL；
细胞系编号GW-P6-T：细胞系名称NCI-H209；
细胞系编号GW-P6-N：细胞系名称NCI-BL209；
其中，细胞系编号GW-PX-T和GW-PX-N中“X”代表上述六对细胞系中的任意一对，“T”代表肿瘤细胞，“N”代表配对细胞，所述GW-PX-T基因组DNA所占的体积比例为1%~99%，所述GW-PX-N基因组DNA所占的体积比例为99%~1%；所述的标准品包含TMB梯度参考品、检测限参考品、重复性参考品；所述TMB梯度参考品的TMB检测值为3~23；所述检测限参考品和/或重复性参考品的GW-PX-T基因组DNA所占的体积比例为1%~99%，GW-PX-N基因组DNA所占的体积比例为99%~1%。


2.一种TMB检测标准品的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）筛选ATCC的配对细胞系
选择如下GW-P1~GW-P6中六对配对细胞系中的一对或多对：
细胞系编号GW-P1-T：细胞系名称NCI-H1770；
细胞系编号GW-P1-N：细胞系名称NCI-BL1770；
细胞系编号GW-P2-T：细胞系名称NCI-H1184；
细胞系编号GW-P2-N：细胞系名称NCI-BL1184；
细胞系编号GW-P3-T：细胞系名称NCI-H128；
细胞系编号GW-P3-N：细胞系名称NCI-BL128；
细胞系编号GW-P4-T：细胞系名称NCI-H2171；
细胞系编号GW-P4-N：细胞系名称NCI-BL2171；
细胞系编号GW-P5-T：细胞系名称COLO829；
细胞系编号GW-P5-N：细胞系名称COLO829BL；
细胞系编号GW-P6-T：细胞系名称NCI-H209；
细胞系编号GW-P6-N：细胞系名称NCI-BL209；
其中，细胞系编号GW-PX-T和GW-PX-N中“X”代表上述六对细胞系中的任意一对，“T”代表肿瘤细胞，“N”代表配对细胞；
（2）gDNA制备
每株细胞系首先进行了STR分型鉴定，以确认细胞类型符合预期；然后，提取gDNA；
（3）DNA浓度测定
使用分光光度计对提取的产物进行DNA浓度的测定，浓度测定，应当连续进行重复检测，应满足如下条件：
浓度：平均浓度20.0ng/μL≤x≤60.0ng/μL，
OD260/280：测定值1.8≤x≤2.0，判定合格，
OD260/230：测定值1.5≤x≤5.0，判定合格；
（4）混合和稀释
①将同一编码和批号细胞沉淀提取的gDNA进行混合，混合前需确认：
待混合gDNA为同一编码和批号的细胞沉淀提取的；
待混合gDNA浓度测定的OD260/280、OD260/230结果合格；
②选择合适体积的管子进行混合；
③测定混合后的浓度及OD值；
④稀释：混合后进行浓度测定，目标稀释浓度为20-60ng/μL；
（5）配对细胞系的混合和质检，将上述六对细胞系的基因组DNA按照不同体积比例进行混合，根据高通量全外显子测序数据进行分析，每一对细胞系挑选一个或多个突变位点设计特异性的探针和引物，采用微滴式数字PCR对原材料原始的突变频率进行确认；
（6）参考品TMB值检测和TMB值计算。


3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤（5）中所述混合的比例为所述GW-PX-T基因组DNA所占的体积比例为1%~99%，所述GW...

【专利技术属性】
技术研发人员：李菁华，韦良慎，梁达超，史鹏燕，林东旭，
申请(专利权)人：菁良基因科技深圳有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44