一种多测序平台通用接头、适用于多测序平台的文库构建方法及试剂盒技术

本发明专利技术涉及一种多测序平台通用接头、适用于多测序平台的文库构建方法及试剂盒，基于多测序平台通用接头的设计及配套快速建库流程的开发，通过一步反应完成DNA片段化、末端修复和dA尾添加，然后在DNA片段两端连接上多测序平台通用接头，所构文库即可同时在多个测序平台上进行高通量测序。该法解决了因测序平台差异造成需多次构建不同测序平台文库的临床难题，大幅缩减了建库时长和成本，同时单次建库的低起始模板量需求也大大节约了临床样本的消耗。

A universal joint for multi sequencing platform, a library construction method and kit for multi sequencing platform

【技术实现步骤摘要】
一种多测序平台通用接头、适用于多测序平台的文库构建方法及试剂盒
本专利技术涉及高通量测序领域，特别是涉及一种多测序平台通用接头、适用于多测序平台的文库构建方法及试剂盒。
技术介绍
随着高通量测序技术的发展，各种生物科学领域的研究和临床机构的检测都涉及到测序文库的构建及高通量测序服务。临床应用的推广带动了高通量测序市场的发展，也对文库构建和测序效率产生了更高要求，文库制备环节的时间和成本已成为广泛推广高通量测序应用的关键因素。高通量DNA文库样本的制备，是将待测序的DNA片段两端连接上与测序平台相匹配的接头序列，即将待测DNA装到一个特定测序载体中的过程。常规的测序文库制备只能在待测序的DNA片段两端连接一个特定测序平台接头，所得文库也只能在特定匹配的测序平台上进行上机检测。比如连接了IonTorrent接头的测序文库只能在IonTorrent高通量测序仪上运行，而无法在Illumina测序平台或其他测序平台上展开检测。同样，基于Illumina接头构建的测序文库只能在Illumina测序平台上运行而无法在IonTorrent测序平台或其他测序平台上展开测试。因此，目前科研机构或临床单位在进行高通量测序时，必须针对所用测序平台，谨慎选择合适的测序方法或匹配的试剂盒。当遇到需要在多个不同测序平台上展开试验时，则需要针对同一样本构建多个适用于不同测序平台的文库，如图1所示，造成了时间和人力物力成本的浪费。当遇到样本稀缺无法满足多次建库时，极大阻碍了进一步的深入检测研究。
技术实现思路
基于此，有必要提供一种适用于多测序平台的文库构建方法及试剂盒。一种适用于多测序平台的文库构建方法，基于多测序平台通用接头的设计及配套快速建库流程的开发，通过一步反应完成DNA片段化、末端修复和dA尾添加，然后在DNA片段两端连接上多测序平台通用接头，所构文库即可同时在多个测序平台上进行高通量测序。该多测序平台通用接头，包括第一测序平台探针结合序列、第二测序平台探针结合序列、第一测序平台引物结合序列、第二测序平台引物结合序列、第一互补序列和第二互补序列；所述第一互补序列和所述第二互补序列反向互补，所述第一测序平台探针结合序列、所述第二测序平台探针结合序列、所述第一测序平台引物结合序列和所述第二测序平台引物结合序列中的至少两条序列分别与所述第一互补序列和所述第二互补序列连接。在其中一个实施例中，第一测序平台为Illumina高通量测序平台，所述第一测序平台探针结合序列为P5序列和P7序列；第二测序平台为IonTorrent高通量测序平台，所述第二测序平台探针结合序列为P1序列；所述第一测序平台引物结合序列为Seq-read1序列和Seq-read2序列，所述第二测序平台引物结合序列为特异A序列。在其中一个实施例中，包括第一接头序列和第二接头序列；所述第一接头序列从5’端到3’端依次包括P5序列、特异A序列、Seq-read1序列和第一互补序列，所述第二接头序列从5’端到3’端依次包括第二互补序列、Seq-read2序列、P1序列和P7序列；所述第一互补序列和所述第二互补序列完全互补，且在所述第一互补序列的3’末端有一个凸出的T碱基。在其中一个实施例中，所述第一接头序列的5’末端与所述第二接头序列的3’末端通过尿嘧啶连接。在其中一个实施例中，多测序平台通用接头包括第一接头序列、第二接头序列、第一扩增引物和第二扩增引物。所述第一接头序列从5’端到3’端依次包括部分特异A序列、Seq-read1序列和第一互补序列，所述第二接头序列从5’端到3’端依次包括第二互补序列、Seq-read2序列和部分P1序列；所述第一扩增引物从5’端到3’端依次包括P5序列和部分特异A序列，所述第二扩增引物从5’端到3’端依次包括P7序列和部分P1序列。所述第一互补序列和所述第二互补序列完全互补，且在所述第一互补序列的3’末端有一个凸出的T碱基。所述第一扩增引物上的特异A序列和所述第一接头序列上的特异A序列有15～25bp的交叠，所述第二扩增引物上的P1序列和所述第二接头序列上的P1序列有15～25bp的交叠。在其中一个实施例中，多测序平台通用接头包括第一接头序列、第二接头序列、第三接头序列和第四接头序列。所述第一接头序列从5’端到3’端依次包括P5序列、Seq-read1序列和第一互补序列，所述第二接头序列从5’端到3’端依次包括第二互补序列和P1序列，所述第三接头序列从5’端到3’端依次包括第二互补序列、Seq-read2序列和P7序列，所述第四接头序列从5’端到3’端依次包括特异A序列和第一互补序列。所述第一互补序列和所述第二互补序列完全互补，且在所述第一互补序列的3’末端有一个凸出的T碱基。所述第一接头序列的第一互补序列和所述第四接头序列的第一互补序列其碱基信息可以不同，所述第二接头序列的第二互补序列和第三接头序列的第二互补序列其碱基信息可以不同。在其中一个实施例中，所述第一接头序列的5’末端与所述第二接头序列的3’末端通过尿嘧啶连接，所述第三接头序列的3’末端与所述第四接头序列的5’末端通过尿嘧啶连接。本专利技术提供一种适用于多测序平台的文库构建方法，在完成DNA片段化、末端修复以及dA尾添加后将DNA片段与上述任一多测序平台通用接头连接。在其中一个实施例中，所述通用多测序平台的文库构建方法为：在一个反应管中将DNA样本与快速酶混合液、快速缓冲液混合，一步完成DNA片段化、末端修复以及dA尾添加；然后DNA片段两端与多测序平台通用接头连接，所构文库即可同时在多个测序平台上进行高通量测序；所述快速酶混合液中含有DNA切刻内切酶I、DNA切刻内切酶II、切口消化酶、T4DNA聚合酶、T4多聚核酸激酶、Klenow大片段、Klenow片段3’→5’exo-和rTaqDNA聚合酶中的多种或全部；所述快速缓冲液中含有Tris-HCl、MgCl2、NaCl、dNTPs、ATP、DTT、BSA和TritonX-100中的多种或全部。在其中一个实施例中，所述快速酶混合液的工作浓度为：DNA切刻内切酶I0.2U/μL～1.0U/μL、DNA切刻内切酶II0U/μL～1.0U/μL、切口消化酶1U/μL～5U/μL、T4DNA聚合酶0.1U/μL～2U/μL、T4多聚核酸激酶1U/μL～5U/μL、Klenow大片段0.1U/μL～1U/μL、Klenow片段3’→5’exo-0.5U/μL～2.0U/μL和rTaqDNA聚合酶0.1U/μL～1U/μL；所述快速缓冲液的工作浓度为：Tris-HCl10mM～80mM、MgCl210mM～50mM、NaCl20mM～80mM、dNTPs0.1mM～0.8mM、ATP0.5mM～2.0mM、DTT5mM～20mM、BSA0.05mg/ml～0.2mg/ml和TritonX-100质量百分比0.1％～0.5％。本专利技术还提供了一种用于文库构建的试剂盒，包括上述多测序平台通用接头、快速酶混合液以及快速缓冲液。本专利技术的多测序平台通用接头中本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种多测序平台通用接头，其特征在于，包括第一测序平台探针结合序列、第二测序平台探针结合序列、第一测序平台引物结合序列、第二测序平台引物结合序列、第一互补序列和第二互补序列；所述第一互补序列和所述第二互补序列反向互补，所述第一测序平台探针结合序列、所述第二测序平台探针结合序列、所述第一测序平台引物结合序列和所述第二测序平台引物结合序列中的至少两条序列分别与所述第一互补序列和所述第二互补序列连接。/n

【技术特征摘要】
1.一种多测序平台通用接头，其特征在于，包括第一测序平台探针结合序列、第二测序平台探针结合序列、第一测序平台引物结合序列、第二测序平台引物结合序列、第一互补序列和第二互补序列；所述第一互补序列和所述第二互补序列反向互补，所述第一测序平台探针结合序列、所述第二测序平台探针结合序列、所述第一测序平台引物结合序列和所述第二测序平台引物结合序列中的至少两条序列分别与所述第一互补序列和所述第二互补序列连接。


2.根据权利要求1所述的多测序平台通用接头，其特征在于，第一测序平台为Illumina高通量测序平台，所述第一测序平台探针结合序列为P5序列和P7序列；第二测序平台为IonTorrent高通量测序平台，所述第二测序平台探针结合序列为P1序列；所述第一测序平台引物结合序列为Seq-read1序列和Seq-read2序列，所述第二测序平台引物结合序列为特异A序列。


3.根据权利要求2所述的多测序平台通用接头，其特征在于，包括第一接头序列和第二接头序列；所述第一接头序列从5’端到3’端依次包括P5序列、特异A序列、Seq-read1序列和第一互补序列，所述第二接头序列从5’端到3’端依次包括第二互补序列、Seq-read2序列、P1序列和P7序列；所述第一互补序列和所述第二互补序列完全互补，且在所述第一互补序列的3’末端有一个凸出的T碱基。


4.根据权利要求3所述的多测序平台通用接头，其特征在于，所述第一接头序列的5’末端与所述第二接头序列的3’末端通过尿嘧啶连接。


5.根据权利要求2所述的多测序平台通用接头，其特征在于，包括第一接头序列、第二接头序列、第一扩增引物和第二扩增引物；所述第一接头序列从5’端到3’端依次包括部分特异A序列、Seq-read1序列和第一互补序列，所述第二接头序列从5’端到3’端依次包括第二互补序列、Seq-read2序列和部分P1序列；所述第一扩增引物从5’端到3’端依次包括P5序列和部分特异A序列，所述第二扩增引物从5’端到3’端依次包括P7序列和部分P1序列；所述第一互补序列和所述第二互补序列完全互补，且在所述第一互补序列的3’末端有一个凸出的T碱基；所述第一扩增引物上的特异A序列和所述第一接头序列上的特异A序列有15～25bp的交叠，所述第二扩增引物上的P1序列和所述第二接头序列上的P1序列有15～25bp的交叠。


6.根据权利要求2所述的多测序平台通用接头，其特征在于，包括第一接头序列、第二接头序列、第三接头序列和第四接头序列；所述第一接头序列从5’端到3’端依次包括P5序列、Seq-read1序列和第一互补序列，所...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵丁丁，孔令印，冒燕，夏琴，梁波，
申请(专利权)人：苏州贝康医疗器械有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32