一种mRNA捕获序列、捕获载体的合成方法、高通量单细胞测序文库制备方法技术

本发明专利技术提供了一种mRNA捕获序列，包括通用引物、稀有酶切位点、细胞标签、随机分子标签和PolyT序列，通过引入稀有酶切位点序列，为后续测序接头连接提供了粘性末端，使cDNA双链两端接上两个不同的测序接头。本发明专利技术还提供了一种用于mRNA捕获的捕获载体的合成方法及一种高通量单细胞测序文库制备方法。本发明专利技术提供的捕获载体通过在基底材料上原位合成引入稀有酶切位点序列的mRNA捕获序列，采用本发明专利技术提供的捕获载体来进行单细胞测序文库的制备，提高单细胞捕获效率以及寡核苷酸标签的标记效率，简化构建文库的流程，并且制得的cDNA双链两端接上两个不同的测序接头，保证一个哑铃型测序文库只组装一条引物及DNA聚合酶，三者的一一对应是保证单分子实时测序的前提。

A method of mRNA capture sequence, synthesis of capture vector and preparation of high throughput single cell sequencing Library

【技术实现步骤摘要】
一种mRNA捕获序列、捕获载体的合成方法、高通量单细胞测序文库制备方法
本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种mRNA捕获序列、捕获载体的合成方法、高通量单细胞测序文库制备方法。
技术介绍
肿瘤是严重影响人类健康的重大疾病之一，肿瘤细胞从基因型到表型上存在极大的差异(肿瘤的高度异质性)，而这种高度异质性与肿瘤的恶性程度、耐药性、复发转移等都密切相关，是造成肿瘤早期诊断困难、临床诊治复杂、耐药复发和预后差的根源之一。全面解析肿瘤异质性是实现肿瘤精准治疗的关键。近年来新兴的单细胞测序技术为解析肿瘤异质性、鉴别不同功能亚群提供了可能。单细胞测序能够获得每个细胞的基因组变异图谱及转录组表达图谱，通过单个细胞的图谱精确划分克隆归属，实现对异质性克隆群体的全面解析。现有单细胞测序技术主要是单细胞捕获、编码技术与二代测序技术的组合，形成了相对成熟的单细胞转录组测序技术。PeterVanGalen等人在Cell发表文献，通过单细胞转录本与三代测序技术相结合，首次实现对白血病患者肿瘤群体(以基因组变异为金标准)中转录组异质性的解析，发现肿瘤群体存在于表达谱不同的多种谱系中，明确了基因组异质性与转录组异质性相互独立又相互影响的关系，也表明在单细胞转录组水平进一步明确细胞的基因组变异的重要性。单细胞测序的流程主要包括单细胞捕获、单细胞编码、测序文库制备和上机测序等环节。现有的单细胞测序技术，单细胞捕获通常通过将单细胞与携带有单细胞捕获序列的磁珠同时放入微液滴或微孔中，这样的操作必须保证一个微单元内有且只有一个单细胞和一个编码磁珠，然而现有技术单细胞和磁珠在微单元内的分布遵循泊松分布，能够满足需求的微单元数量小于10％，微单元利用率低，限制了该方法的单细胞处理通量。现有单细胞捕获也可以通过将捕获序列偶联在微孔上，再将单细胞放入微孔内，现有技术通过将预先合成的寡核苷酸序列，通过点样的方式加入目标微孔中，依次接枝偶联。因为每个微孔内的序列都不相同，在进行高通量分析时，需要的寡核苷酸序列库和点样接枝的工作量极为庞大，现有技术难以实现万级以上微孔的修饰工作，因此检测通量受到极大限制。此外，现有的单细胞测序技术通常两端连接同样的测序接头，很难实现在cDNA双链模板两端连接两个不同的测序接头。因此，如何提高单细胞测序技术中单细胞捕获的准确性和通量、如何使cDNA双链模板两端连接两个不同的测序接头为本领域面临的一技术难题。
技术实现思路
为了克服现有技术的不足，本专利技术的一个目的是提供一种mRNA捕获序列，引入稀有酶切位点序列，为后续测序接头连接提供了粘性末端，进而使cDNA双链两端接上两个不同的测序接头，可以保证一个哑铃型测序文库只组装一条引物及DNA聚合酶，三者的一一对应是保证单分子实时测序的前提。本专利技术的第一个目的是提供一种mRNA捕获序列，所述mRNA捕获序列为一条寡聚核苷酸，包括通用引物、稀有酶切位点、细胞标签、随机分子标签和PolyT序列。优选地，所述mRNA捕获序列的结构为通用引物-稀有酶切位点-细胞标签-随机分子标签-PolyT序列，序列长度为38～180bp；其中，所述通用引物序列用以引发cDNA双链PCR，实现cDNA链的复制，序列长度3～20bp；所述稀有酶切位点用以由限制性内切酶特异性识别并剪切，序列长度为10～30bp，所述限制性内切酶包括但不限于AgeI、ApoI、BamHI、BbsI、BclI、BmtI、BsaI、BsiWI、BsrGI、BstEII、BstZ17I、DraIII、EagI、EcoRI、EcoRV、HindIII、KpnI、MfeI、MluI、NcoI、NheI、NotI、NruI、NsiI、PstI、PvuI、PvuII、SacI、SalI、SbfI、ScaI、SpeI、SphI、SspI、StyI；所述细胞标签用以编码单细胞，序列长度5～50bp，以使同一细胞来源的mRNA编码相同细胞标签序列，不同细胞来源的mRNA编码不同细胞标签序列；所述随机分子标签用以编码mRNA，序列长度10～30bp，以使每一条mRNA携带不同的分子标签序列；PolyT序列由胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸的重复序列组成，序列长度10～50bp，用以捕获携带PolyA的mRNA。本专利技术的第二个目的是提供一种用于mRNA捕获的捕获载体的合成方法，包括以下步骤：步骤一，选择含有若干微反应单元的基底材料，通过化学修饰方法在所述微反应单元内形成若干用以接枝寡聚核苷酸的表面官能团；步骤二，以步骤一所形成用以接枝寡聚核苷酸的表面官能团为起始点，在每一所述微反应单元内原位合成若干如权利要求1或2所述的mRNA捕获序列，制得用于mRNA捕获的捕获载体。优选地，所述基底材料包括但不限于微孔阵列、微球、磁珠、凝胶微球、树脂填料。优选地，所述基底材料为微孔阵列，所述微孔阵列包括1～100万个微孔数量，所述微孔具有在一个微孔中只能容纳单个细胞的尺寸和形状。优选地，所述微孔结构横截面为圆形，纵截面包括但不限于长方形、正方形、正“T”字形、倒梯形；和/或，所述微孔底部设有滤膜。优选地，所述用以接枝寡聚核苷酸的表面官能团包括但不限于氨基、羟基、巯基、羧基。优选地，所述的原位化学合成如权利要求1或2所述的mRNA捕获序列的方法，包括但不限于光化学合成法、喷墨打印法。本专利技术的第三个目的是提供一种高通量单细胞测序文库制备方法，包括以下步骤：S1、利用如权利要求3所述的合成方法制得的用于mRNA捕获的捕获载体的微反应单元捕获单细胞；S2、单细胞进行裂解，释放mRNA，所述微反应单元内的mRNA捕获序列中的PoLYT与mRNA上的PolyA特异性结合，逆转录合成cDNA；S3、置换缓冲液，加入携带复制引物的微球，进行PCR扩增反应，形成完整的cDNA双链模板，其中，所述复制引物与所述微反应单元内的mRNA捕获序列上的通用引物序列相同；S4、回收微球并合并，清洗置换缓冲液，在cDNA双链模板末端接第一粘性末端；S5、清洗并置换缓冲液；S6、酶切将cDNA双链模板的第二粘性末端暴露；S7、在S5步骤或本步骤中利用DNA连接酶连接第一测序接头；利用DNA连接酶连接第二测序接头，形成哑铃型测序文库，纯化文库；S8、测序引物和测序酶与哑铃型测序文库组装；S9、将组装好的文库填入纳米孔芯片中，并且锚定在纳米孔底部，上机测序。优选地，所述第一粘性末端与所述第二粘性末端不同，所述第一测序接头与所述第二测序接头不同；所述微球的尺寸1～50微米；所述的PCR过程循环数为1～100。优选地，所述微球为磁性微球，所述微球的尺寸10～30微米；所述微球的所述的PCR过程循环数为1～10。优选地，所述第一测序接头、第二测序接头均为发卡型寡聚核苷酸；其中，所述第一测序接头包括第一互补序列和第三粘性末端序列，所述第三粘性末端序列与cDNA双链模板末端的第一粘性末端互本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种mRNA捕获序列，其特征在于，所述mRNA捕获序列为一条寡聚核苷酸，包括通用引物、稀有酶切位点、细胞标签、随机分子标签和PolyT序列。/n

【技术特征摘要】
1.一种mRNA捕获序列，其特征在于，所述mRNA捕获序列为一条寡聚核苷酸，包括通用引物、稀有酶切位点、细胞标签、随机分子标签和PolyT序列。


2.根据权利要求1所述的一种mRNA捕获序列，其特征在于，所述mRNA捕获序列的结构为通用引物-稀有酶切位点-细胞标签-随机分子标签-PolyT序列，序列长度为38～180bp；其中，
所述通用引物序列用以引发cDNA双链PCR，实现cDNA链的复制，序列长度3～20bp；
所述稀有酶切位点用以由限制性内切酶特异性识别并剪切，序列长度为10～30bp，所述限制性内切酶包括AgeI、ApoI、BamHI、BbsI、BclI、BmtI、BsaI、BsiWI、BsrGI、BstEII、BstZ17I、DraIII、EagI、EcoRI、EcoRV、HindIII、KpnI、MfeI、MluI、NcoI、NheI、NotI、NruI、NsiI、PstI、PvuI、PvuII、SacI、SalI、SbfI、ScaI、SpeI、SphI、SspI、StyI；
所述细胞标签用以编码单细胞，序列长度5～50bp，以使同一细胞来源的mRNA编码相同细胞标签序列，不同细胞来源的mRNA编码不同细胞标签序列；
所述随机分子标签用以编码mRNA，序列长度10～30bp，以使每一条mRNA携带不同的分子标签序列；
PolyT序列由胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸的重复序列组成，序列长度10～50bp，用以捕获携带PolyA的mRNA。


3.一种用于mRNA捕获的捕获载体的合成方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一，选择含有若干微反应单元的基底材料，通过化学修饰方法在所述微反应单元内形成若干用以接枝寡聚核苷酸的表面官能团；
步骤二，以步骤一所形成用以接枝寡聚核苷酸的表面官能团为起始点，在每一所述微反应单元内原位合成若干如权利要求1或2所述的mRNA捕获序列，制得用于mRNA捕获的捕获载体。


4.根据权利要求3所述的一种用于mRNA捕获的捕获载体的合成方法，其特征在于，所述基底材料包括微孔阵列、微球、磁珠、凝胶微球、树脂填料。


5.根据权利要求4所述的一种用于mRNA捕获的捕获载体的合成方法，其特征在于，所述基底材料为微孔阵列，所述微孔阵列包括1～100万个微孔数量，所述微孔具有在一个微孔中只能容纳单个细胞的尺寸和形状。


6.根据权利要求5所述的一种用于mRNA捕获的捕获载体的合成方法，其特征在于，所述微孔结构横截面为圆形，纵截面包括长方形、正方形、正“T”...

【专利技术属性】
技术研发人员：李金泽，周连群，张威，郭振，张芷齐，李超，李传宇，姚佳，
申请(专利权)人：中国科学院苏州生物医学工程技术研究所，
类型：发明
国别省市：江苏;32