一种DNA上5-羟甲基尿嘧啶的特异性标记方法技术

本发明专利技术公开了一种DNA上5‑羟甲基尿嘧啶的特异性标记方法，属于分子生物学技术领域。该特异性标记方法利用从铜绿假单胞菌噬菌体M6中分离出的5‑hmU激酶实现γ‑硫代磷酸酯从5‑O‑硫代三磷酸腺苷转移到5‑hmU，产生5‑硫代磷酸甲基尿嘧啶；然后，通过液相色谱‑串联质谱法对产生的5‑硫代磷酸甲基尿嘧啶进行表征，并利用交联化学标记巯基对DNA上的5‑羟甲基尿嘧啶实现特异性标记。本发明专利技术的方法有效克服了检测样品需求量大、化学反应条件苛刻、反应效率低等缺点。

A specific labeling method of 5-hydroxymethyluracil on DNA

【技术实现步骤摘要】
一种DNA上5-羟甲基尿嘧啶的特异性标记方法
本专利技术属于分子生物学
，涉及一种DNA上5-羟甲基尿嘧啶的特异性标记方法。
技术介绍
基因组中除了四个经典碱基外，还包含经过化学修饰的DNA碱基。这些修饰的碱基可以由内源酶或外源因子产生，它们有可能深刻影响基因组功能和细胞过程。已经发现了许多修饰的DNA碱基，其中哺乳动物基因组中最著名的是5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine，5mC)及其氧化衍生物5-羟甲基胞嘧啶(5-hydroxymethylcytosine，5-hmC)，5-氟胞嘧啶(5-formylcytosine，5-fC)和5-羧基胞嘧啶(5-carboxylcytosine，5-caC)。这些表观遗传标记已被证明在调节基因表达中起重要作用。DNA的甲基化修饰自1948年被发现以来,一直都是表观遗传领域的研究热点。DNA的甲基化修饰赋予了DNA双链除蛋白质编码信息外的表观遗传记忆，对基因组稳定性、基因表达和发育具有深远的影响。在2014年研究人员首次报道了TET酶可以氧化胸腺嘧啶变成5-hmU，这一结果揭示了胸腺嘧啶(T)的氧化产物(5-hmU、5-fU、5-caU)可能存在着一定的表观学意义。5-hmU是在各种生物的基因组中鉴定出的胸腺嘧啶衍生物。在哺乳动物中，5-hmU是通过复制后加工机制形成的，这些机制包括通过一个10-11易位酶(TET)或活性氧(ROS)和5-hmC脱氨基的胸腺嘧啶羟基化。不过基因组DNA中修饰碱基的水平受许多因素的影响，例如细胞或组织的类型以及生物的疾病状态。mES细胞中5-hmU的大部分由TET酶氧化酶产生，而5-hmC的脱氨或ROS途径很少。因此，匹配的5-hmU：A而非错配的5-hmU：G是哺乳动物基因组中5-hmU的主要存在形式。当前已经有研究表明5-hmU几乎没有胸腺嘧啶残基的组成，例如在mES细胞中5-hmU约占0.00005％，丰度仅为5-hmC的0.1％。这就使得对hmU的分析变得十分困难，并且5-hmU和5-hmC之间的结构相似性也阻碍了对这些修饰的区分。因此，需要一种有效的标记DNA上5-hmU的方法，以进一步识别和联合检测、探索其生物学功能。当前DNA样品中5-hmC的检测方法是通过化学氧化将5-hmU转化为5-fU，来检测基因组5-hmU。通过在聚合酶延伸反应过程中形成5-fU：G碱基配对，两种诱导的T到C碱基发生变化。但是，这种诱导变化的效率较低，即使在优化条件下，这种碱基改变的比例也低于40％，并且无法使用功能标签标记5-hmU。此外，还有其他5-hmU的检测方法。有研究表明醛基修饰的尿嘧啶(5fU)可能在表观遗传学中也会起到一定的作用，例如在引入碱基错配，改变DNA的结构等。传统的5fU-DNA链的合成主要通过Pt催化氧化、锇氧化、高碘酸钠氧化等，由于其使用的催化剂剧毒限购，对设备要求高，使得很长时间5fU-DNA合成没有显著的突破。为了解决这一问题，研究人员设计合成一个生物素化的探针，该探针偶联有生物素，可以在后期应用于生物素-亲合素系统(Biotin-Avidin—System,BAS)，实现对5fU的选择性富集。然而，这种方法也对基因组DNA中存在的其他带有醛基的组分具有很高的反应性。因此，需要有一种有效的标记DNA上5-hmU的方法，以进一步识别和联合检测、探索其生物学功能。
技术实现思路
为了克服上述现有技术的缺点，本专利技术的目的在于提供一种DNA上5-羟甲基尿嘧啶的特异性标记方法，该方法解决了现有技术中检测样品需求量大、化学反应条件苛刻、反应效率低等问题。为了达到上述目的，本专利技术采用以下技术方案予以实现：本专利技术公开了一种DNA上5-羟甲基尿嘧啶的特异性标记方法，利用从铜绿假单胞菌噬菌体M6中分离出的5-hmU激酶实现γ-硫代磷酸酯从5-O-硫代三磷酸腺苷转移到5-hmU，产生5-硫代磷酸甲基尿嘧啶；然后，通过液相色谱-串联质谱法对产生的5-硫代磷酸甲基尿嘧啶进行表征，并利用交联化学标记巯基对DNA上的5-羟甲基尿嘧啶实现特异性标记。本专利技术所用的5-hmU是从铜绿假单胞菌噬菌体M6中分离得到的激酶，直接购买得到。优选地，产生5-硫代磷酸甲基尿嘧啶的具体操作如下：1)制备含有用于限制性核酸内切酶NcoI的识别序列的dsDNA寡核苷酸作为5-hmU激酶的底物；2)通过体外DNA聚合酶催化引物的延伸，制备包含不同碱基对位点的dsDNA模型底物；3)将含5-hmU：A的dsDNA产物与G模板一起温育进行链置换反应；4)采用5-hmU激酶使ATP-γ-S硫代磷酸化5-hmU：A中的5-hmU残基，得到5-硫代磷酸甲基尿嘧啶。进一步优选地，步骤1)中，用于限制性核酸内切酶NcoI的识别序列为5'-CCAXGG-3'，其中，X＝T，U，hmU和fU。进一步优选地，步骤2)中，不同碱基对包括：5hmU：A，5hmC：G，5fC：G，5fU：A，U：A或T：A。进一步优选地，步骤4)具体操作如下：向样品中加入10U5-hmU激酶和1mMATP-γ-S，在浓度为1×的Cutsmart缓冲液反应体系中，在37℃，300rpm条件下振荡反应2小时，然后将微凝胶用1xPBS洗涤3次，得到5-硫代磷酸甲基尿嘧啶。优选地，利用交联化学标记巯基的具体操作如下：通过加入不同的巯基反应性试剂(碘酰-炔基、卤代乙酰基和马来酰亚胺等)与硫代磷酸酯基进行巯基反应，对不同5-hmU位点进行特异性识别和标记，以在同一基因组DNA样品或者单个细胞中区分5-hmU。进一步优选地，巯基反应在37℃、避光条件下反应1h。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：本专利技术利用铜绿假单胞菌噬菌体M6的5-hmUDNA激酶(5-HMUDK)实现了γ-硫代磷酸酯从5-O-硫代三磷酸腺苷(ATP-γ-S)转移到5-hmU，产生5-硫代磷酸甲基尿嘧啶(5psmU)。通过液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)技术对所产生的5psmU进行检测，随后通过交联化学标记巯基实现DNA上5-hmU的特异性标记。具体优势如下：1)本专利技术所述的标记方法，能够进行选择性的5-hmU识别和标记，即可避免其他碱基化学修饰带来的误差，实现准确识别标记。2)本专利技术所述的ATP-γ-S，是ATP依赖酶系统的底物和抑制剂,能被磷酸酶和大多数ATP酶水解，但是水解过程很慢。且一旦硫代磷酸酶被磷酸化，蛋白质就会对蛋白质磷酸酶产生抗性。ATP-γ-S是ATP中最远的那个磷酸基上的双键氧变成S原子，在5-HMUDK的作用下能够将γ-硫代磷酸酯转移到目标物，然后就可以对基因组DNA上的目标物进行识别和标记，提高分析的准确度与灵敏度。3)本专利技术所述的5-硫代磷酸甲基尿嘧啶(5psmU)，是ATP-γ-S在HMUDK的作用下将γ硫代磷酸转移到5-hmU上所生成。随后通过交联化学标记巯基实现DNA上5-hmU的特异性标记。该反应是一种高产率、反应条件简单、反本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种DNA上5-羟甲基尿嘧啶的特异性标记方法，其特征在于，利用5-hmU激酶实现γ-硫代磷酸酯从5-O-硫代三磷酸腺苷转移到5-hmU，产生5-硫代磷酸甲基尿嘧啶；然后，通过液相色谱-串联质谱法对产生的5-硫代磷酸甲基尿嘧啶进行表征，并利用交联化学标记巯基对DNA上的5-羟甲基尿嘧啶实现特异性标记。/n

【技术特征摘要】
1.一种DNA上5-羟甲基尿嘧啶的特异性标记方法，其特征在于，利用5-hmU激酶实现γ-硫代磷酸酯从5-O-硫代三磷酸腺苷转移到5-hmU，产生5-硫代磷酸甲基尿嘧啶；然后，通过液相色谱-串联质谱法对产生的5-硫代磷酸甲基尿嘧啶进行表征，并利用交联化学标记巯基对DNA上的5-羟甲基尿嘧啶实现特异性标记。


2.根据权利要求1所述的DNA上5-羟甲基尿嘧啶的特异性标记方法，其特征在于，产生5-硫代磷酸甲基尿嘧啶的具体操作如下：
1)制备含有用于限制性核酸内切酶NcoI的识别序列的dsDNA寡核苷酸作为5-hmU激酶的底物；
2)通过体外DNA聚合酶催化引物的延伸，制备包含不同碱基对位点的dsDNA模型底物；
3)将含5-hmU：A的dsDNA产物与G模板一起温育进行链置换反应；
4)采用5-hmU激酶使ATP-γ-S硫代磷酸化5-hmU：A中的5-hmU残基，得到5-硫代磷酸甲基尿嘧啶。


3.根据权利要求2所述的DNA上5-羟甲基尿嘧啶的特异性标记方法，其特征在于，步骤1)中，用于限制性核酸内切酶NcoI的识别序列为5'-CCAXGG-3'...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵永席，陈锋，白敏，张进，
申请(专利权)人：西安交通大学，
类型：发明
国别省市：陕西;61