一种DNA上5-羟甲基尿嘧啶的特异性标记方法技术

本发明专利技术公开了一种DNA上5‑羟甲基尿嘧啶的特异性标记方法，属于分子生物学技术领域。该特异性标记方法利用从铜绿假单胞菌噬菌体M6中分离出的5‑hmU激酶实现γ‑硫代磷酸酯从5‑O‑硫代三磷酸腺苷转移到5‑hmU，产生5‑硫代磷酸甲基尿嘧啶；然后，通过液相色谱‑串联质谱法对产生的5‑硫代磷酸甲基尿嘧啶进行表征，并利用交联化学标记巯基对DNA上的5‑羟甲基尿嘧啶实现特异性标记。本发明专利技术的方法有效克服了检测样品需求量大、化学反应条件苛刻、反应效率低等缺点。

A specific labeling method of 5-hydroxymethyluracil on DNA

【技术实现步骤摘要】
一种DNA上5-羟甲基尿嘧啶的特异性标记方法
本专利技术属于分子生物学
，涉及一种DNA上5-羟甲基尿嘧啶的特异性标记方法。
技术介绍
基因组中除了四个经典碱基外，还包含经过化学修饰的DNA碱基。这些修饰的碱基可以由内源酶或外源因子产生，它们有可能深刻影响基因组功能和细胞过程。已经发现了许多修饰的DNA碱基，其中哺乳动物基因组中最著名的是5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine，5mC)及其氧化衍生物5-羟甲基胞嘧啶(5-hydroxymethylcytosine，5-hmC)，5-氟胞嘧啶(5-formylcytosine，5-fC)和5-羧基胞嘧啶(5-carboxylcytosine，5-caC)。这些表观遗传标记已被证明在调节基因表达中起重要作用。DNA的甲基化修饰自1948年被发现以来,一直都是表观遗传领域的研究热点。DNA的甲基化修饰赋予了DNA双链除蛋白质编码信息外的表观遗传记忆，对基因组稳定性、基因表达和发育具有深远的影响。在2014年研究人员首次报道了TET酶可以氧化胸腺嘧啶变成5-hmU，这一结果揭示了胸腺嘧啶本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种DNA上5-羟甲基尿嘧啶的特异性标记方法，其特征在于，利用5-hmU激酶实现γ-硫代磷酸酯从5-O-硫代三磷酸腺苷转移到5-hmU，产生5-硫代磷酸甲基尿嘧啶；然后，通过液相色谱-串联质谱法对产生的5-硫代磷酸甲基尿嘧啶进行表征，并利用交联化学标记巯基对DNA上的5-羟甲基尿嘧啶实现特异性标记。/n

【技术特征摘要】
1.一种DNA上5-羟甲基尿嘧啶的特异性标记方法，其特征在于，利用5-hmU激酶实现γ-硫代磷酸酯从5-O-硫代三磷酸腺苷转移到5-hmU，产生5-硫代磷酸甲基尿嘧啶；然后，通过液相色谱-串联质谱法对产生的5-硫代磷酸甲基尿嘧啶进行表征，并利用交联化学标记巯基对DNA上的5-羟甲基尿嘧啶实现特异性标记。


2.根据权利要求1所述的DNA上5-羟甲基尿嘧啶的特异性标记方法，其特征在于，产生5-硫代磷酸甲基尿嘧啶的具体操作如下：
1)制备含有用于限制性核酸内切酶NcoI的识别序列的dsDNA寡核苷酸作为5-hmU激酶的底物；
2)通过体外DNA聚合酶催化引物的延伸，制备包含不同碱基对位点的dsDNA模型底物；
3)将含5-hmU：A的dsDNA产物与G模板一起温育进行链置换反应；
4)采用5-hmU激酶使ATP-γ-S硫代磷酸化5-hmU：A中的5-hmU残基，得到5-硫代磷酸甲基尿嘧啶。


3.根据权利要求2所述的DNA上5-羟甲基尿嘧啶的特异性标记方法，其特征在于，步骤1)中，用于限制性核酸内切酶NcoI的识别序列为5'-CCAXGG-3'...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵永席，陈锋，白敏，张进，
申请(专利权)人：西安交通大学，
类型：发明
国别省市：陕西;61