用于病毒检测的基于CRISPR效应系统的诊断技术方案

本文提供了一种核酸检测系统，所述核酸检测系统包括：CRISPR系统，所述CRISPR系统包含效应蛋白和一种或多种被设计成结合至相应靶分子的向导RNA；基于RNA的掩蔽构建体；以及任选地，用以扩增样品中的靶RNA分子的核酸扩增试剂。在另一个方面，实施方案提供了一种多肽检测系统，所述多肽检测系统包括：CRISPR系统，所述CRISPR系统包含效应蛋白和一种或多种被设计成结合触发RNA的向导RNA；基于RNA的掩蔽构建体；以及一种或多种检测适体，所述一种或多种检测适体包含掩蔽的RNA聚合酶启动子结合位点或掩蔽的引物结合位点。在一些实施方案中，所述系统可以用于检测样品中的病毒。

Diagnosis based on CRISPR effect system for virus detection

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于病毒检测的基于CRISPR效应系统的诊断相关申请的交叉引用本申请要求2017年3月15日提交的美国临时申请号62/471,931、2017年4月12日提交的美国临时申请62/484,857、2017年7月7日提交的美国临时申请62/530,086、2017年10月5日提交的美国临时申请62/568,315、2017年11月17日提交的美国临时申请U.S.62/588,138和2017年12月8日提交的美国临时申请62/596,735的优先权。以上确认的申请的全部内容特此以引用的方式完全并入本文中。关于联邦资助研究的声明本专利技术是在政府支持下根据国家卫生研究院(NationalInstitutesofHealth)授予的授权号MH100706、MH110049、AI110818和国防威胁降低局(DefenseThreatReductionAgency)授予的授权号HDTRA1-14-1-0006进行。政府对本专利技术具有某些权利。
本文所公开的主题大体上关于与CRISPR效应系统的使用相关的快速诊断。
技术介绍
核酸是生物信息的通用标识。在便携平台上以高灵敏度和单碱基特异性快速检测核酸的能力具有以下潜力：为许多疾病的诊断和监测带来革新，提供有价值的流行病学信息，并且用作可泛化的科学工具。尽管已经开发许多方法用于检测核酸(Du等,2017；Green等,2014；Kumar等,2014；Pardee等,2014；Pardee等,2016；Urdea等,2006)，但其不可避免地在灵敏度、特异性、简易性和速度当中有所权衡。举例来说，qPCR方法是灵敏但昂贵的并且依赖复杂的仪器，这限制了在实验室设置中训练有素的操作者的可用性。其它方法，例如组合等温核酸扩增与便携平台的新方法(Du等,2017；Pardee等,2016)，在定点护理(POC)设置中提供高检测特异性，但归因于低灵敏度而具有稍受限制的应用。因为核酸诊断对于多种保健应用变得日益相关，所以在低成本下提供高特异性和灵敏度的检测技术将在临床与基础研究设置中具有很大效用。
技术实现思路
在一个方面，本专利技术提供了一种核酸检测系统，所述核酸检测系统包括：CRISPR系统，所述CRISPR系统包含效应蛋白和一种或多种被设计成结合至相应靶分子的向导RNA；基于RNA的掩蔽构建体；以及任选地，用以扩增样品中的靶RNA分子的核酸扩增试剂。在另一个方面，实施方案提供了一种多肽检测系统，所述多肽检测系统包括：CRISPR系统，所述CRISPR系统包含效应蛋白和一种或多种被设计成结合触发RNA的向导RNA；基于RNA的掩蔽构建体；以及一种或多种检测适体，所述一种或多种检测适体包含掩蔽的RNA聚合酶启动子结合位点或掩蔽的引物结合位点。在其它实施方案中，系统还可以包含核酸扩增试剂。核酸扩增试剂可以包括包含RNA聚合酶启动子的引物。在某些实施方案中，扩增样品核酸以获得包含RNA聚合酶启动子的DNA模板，借此通过转录可以产生靶RNA分子。核酸可以是DNA并且通过本文所描述的任何方法扩增。核酸可以是RNA并且通过如本文所描述的逆转录方法扩增。在引物结合位点的去掩蔽之后可以扩增适体序列，借此从扩增的DNA产物转录触发RNA。靶分子可以是靶DNA，并且系统还可以包含结合靶DNA并且包含RNA聚合酶启动子的引物。在一个示例性实施方案中，CRISPR系统效应蛋白是RNA靶向效应蛋白。示例性RNA靶向效应蛋白包括C2c2(现称为Cas13a)、Cas13b和Cas13a。将了解，术语“C2c2”在本文中与“Cas13a”可互换使用。在另一个示例性实施方案中，RNA靶向效应蛋白是C2c2。在其它实施方案中，C2c2效应蛋白来自选自由以下组成的组的属类的生物体：纤毛菌属(Leptotrichia)、李斯特菌属(Listeria)、棒杆菌属(Corynebacter)、萨特氏菌属(Sutterella)、军团菌属(Legionella)、密螺旋体属(Treponema)、产线菌属(Filifactor)、真杆菌属(Eubacterium)、链球菌属(Streptococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、支原体属(Mycoplasma)、拟杆菌属(Bacteroides)、弗维菌属(Flaviivola)、黄杆菌属(Flavobacterium)、单丝壳属(Sphaerochaeta)、固氮螺菌属(Azospirillum)、葡糖醋杆菌属(Gluconacetobacter)、奈瑟氏菌属(Neisseria)、罗氏菌属(Roseburia)、细小棒菌属(Parvibaculum)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、硝酸盐裂解菌属(Nitratifractor)、支原体属、弯曲杆菌属(Campylobacter)和毛螺菌属(Lachnospira)，或C2c2效应蛋白是选自由以下组成的组的生物体：沙氏纤毛菌(Leptotrichiashahii)、韦德纤毛菌(Leptotrichiawadei)、斯氏李斯特菌(Listeriaseeligeri)、嗜氨基梭菌(Clostridiumaminophilum)、鸡肉杆菌(Carnobacteriumgallinarum)、普根沼杆菌(Paludibacterpropionicigenes)、维森李斯特菌(Listeriaweihenstephanensis)，或C2c2效应蛋白是韦德纤毛菌(L.wadei)F0279或韦德纤毛菌F0279(Lw2)C2C2效应蛋白。在另一个实施方案中，一种或多种向导RNA被设计成检测单核苷酸多态性、转录物的剪接变体或者靶RNA或DNA中的框移突变。在其它实施方案中，一种或多种向导RNA被设计成结合至一种或多种作为疾病病况的诊断的靶分子。在其它实施方案中，疾病病况是感染、器官疾病、血液疾病、免疫系统疾病、癌症、脑和神经系统疾病、内分泌疾病、妊娠或分娩相关疾病、遗传性疾病或环境获得性疾病。在其它实施方案中，疾病病况是癌症或自身免疫疾病或感染。在其它实施方案中，一种或多种向导RNA被设计成结合至一种或多种包含癌症特异性体细胞突变的靶分子。癌症特异性突变可以赋予抗药性。抗药性突变可以由依鲁替尼(ibrutinib)、埃罗替尼(erlotinib)、伊马替尼(imatinib)、吉非替尼(gefitinib)、克唑替尼(crizotinib)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、威罗菲尼(vemurafenib)、RAF/MEK、检查点阻断疗法或抗雌激素疗法的治疗来诱导。癌症特异性突变可以存在于一种或多种编码选自由以下组成的组的蛋白质的基因中：程序性死亡配体1(PD-L1)、雄激素受体(AR)、布鲁顿氏酪氨酸激酶(Bruton'sTyrosineKinase)(BTK)、表皮生长因子受体(EGFR)、BCR-Abl、c-kit、PIK3CA、HER2、EML4-ALK、KRAS、ALK、ROS1、AKT1、BRAF、MEK1、MEK2、NRAS、RAC1和ESR1。癌症特异性本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种核酸检测系统，所述核酸检测系统包括：/nCRISPR系统，所述CRISPR系统包含效应蛋白和一种或多种被设计成结合至相应靶分子的向导RNA；以及/n基于RNA的掩蔽构建体；/n其中所述靶分子包括一种或多种病毒靶分子。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170315 US 62/471,931;20170412 US 62/484,857;20171.一种核酸检测系统，所述核酸检测系统包括：
CRISPR系统，所述CRISPR系统包含效应蛋白和一种或多种被设计成结合至相应靶分子的向导RNA；以及
基于RNA的掩蔽构建体；
其中所述靶分子包括一种或多种病毒靶分子。


2.一种多肽检测系统，所述多肽检测系统包括：
CRISPR系统，所述CRISPR系统包含效应蛋白和一种或多种被设计成结合至触发RNA的向导RNA；
基于RNA的掩蔽构建体；以及
一种或多种检测适体，所述一种或多种检测适体包含掩蔽的RNA聚合酶启动子结合位点或掩蔽的引物结合位点。


3.一种用于检测样品中的病毒的方法，所述方法包括：
将样品或样品组分配至一个或多个个别离散容积中，所述个别离散容积包含如权利要求1或2所述的CRISPR系统；
在足以允许所述一种或多种向导RNA结合至一种或多种靶分子的条件下孵育所述样品或样品组；
经由所述一种或多种向导RNA结合至所述一种或多种靶分子来活化所述CRISPR效应蛋白，其中活化所述CRISPR效应蛋白得以修饰所述基于RNA的掩蔽构建体以便产生可检测的阳性信号；以及
检测所述可检测的阳性信号，其中检测到所述可检测的阳性信号指示所述样品中一种或多种病毒的存在。


4.如权利要求3所述的方法，其中所述样品包含两种或更多种病毒，并且其中所述方法区分所述两种或更多种病毒。


5.如权利要求3或4所述的方法，其中所述向导RNA检测所述一种或多种病毒的单核苷酸变体。


6.如权利要求5所述的方法，其中所述向导RNA还包含一个或多个合成错配。


7.如权利要求3至5中任一项所述的方法，其中所述一种或多种CRISPR系统的所述向导RNA包含检测一组病毒中的每种病毒和/或病毒株的泛病毒向导RNA组。


8.如权利要求7所述的方法，其中所述向导RNA是使用组覆盖方法得到。


9.一种用于检测病毒的方法，所述方法包括：
使如权利要求1或2中任一项所述的CRISPR系统暴露于样品；
经由所述一种或多种向导RNA结合至所述一种或多种微生物特异性靶RNA或所述一种或多种触发RNA来活化所述RNA效应蛋白以便产生可检测的阳性信号；以及
检测所述可检测的阳性信号，其中检测到所述可检测的阳性信号指示所述样品中一种或多种病毒的存在。


10.如权利要求9所述的方法，其中所述CRISPR系统在衬底上，并且其中使所述衬底暴露于所述样品。


11.如权利要求10所述的方法，其中将相同或不同CRISPR系统施加至所述衬底上的多个离散位置。


12.如权利要求11所述的方法，其中将相同或不同CRISPR系统施加至所述衬底上的多个离散位置。


13.如权利要求10至12中任一项所述的方法，其中所述衬底是柔性材料衬底。


14.如权利要求13所述的方法，其中所述柔性材料衬底是纸衬底、织物衬底或基于柔性聚合物的衬底。


15.如权利要求12所述的方法，其中所述不同CRISPR系统检测每个位置处的不同微生物。


16.如权利要求13所述的方法，其中通过将所述衬底短暂浸入有待取样的流体中，通过将有待测试的流体施加至所述衬底，或通过使有待测试的表面与所述衬底接触，使所述衬底被动暴露于所述样品。


17.如权利要求16所述的方法，其中所述样品是生物或环境样品。


18.如权利要求17所述的方法，其中所述环境样品获自食物样品、饮料样品、纸表面、织物表面、金属表面、木材表面、塑料表面、土壤样品、淡水样品、废水样品、盐水样品、暴露于大气或其它气体样品，或其组合。


19.如权利要求17所述的方法，其中所述生物样品获自组织样品、唾液、血液、血浆、血清、粪便、尿液、痰液、粘液、淋巴、滑液、脑脊髓液、腹水、胸腔积液、血清肿、脓液，或皮肤或粘膜表面的拭子。


20.如权利要求17至19中任一项所述的方法，其中所述环境样品或生物样品是粗样品和/或其中在应用所述方法之前所述一种或多种靶分子未从所述样品纯化或扩增。


21.一种用于监测病毒性疾病爆发和/或演变的方法，所述方法包括：
使如权利要求1或2所述的CRISPR系统暴露于样品；
经由所述一种或多种向导RNA结合至一种或多种包含非同义病毒突变的靶序列来活化所述RNA效应蛋白以便产生可检测的阳性信号；以及
检测所述可检测的阳性信号，其中检测到所述可检测的阳性信号指示所述样品中存在的病毒株的类型。


22.如权利要求21所述的方法，其中暴露所述CRISPR系统包括使一种或多种CRISPR系统定位于一个或多个个别离散容积内以及将样品或样品等分试样添加至所述一个或多个个别离散容积中。


23.一种用于针对病毒抗原和/或病毒特异性抗体筛选样品的方法，所述方法包括：
使如权利要求2所述的CRISPR系统暴露于样品，其中所述一种或多种适体结合至一种或多种病毒抗原或一种或多种病毒特异性抗体，并且其中所述适体编码鉴别所述一种或多种适体所结合的所述一种或多种病毒抗原或所述一种或多种病毒特异性抗体的条形码，并且其...

【专利技术属性】
技术研发人员：O·阿布达耶，J·戈滕贝格，E·S·兰德，P·萨贝蒂，C·A·弗雷杰，C·梅尔沃德，J·J·柯林斯，F·张，
申请(专利权)人：博德研究所，麻省理工学院，哈佛学院院长等，
类型：发明
国别省市：美国;US