【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】分子库制备方法以及其组合物和用途相关申请案本申请案根据35USC§119(e)要求2017年6月30日提交的美国临时申请案第62/527,893号、2018年1月6日提交的美国临时申请案第62/614,362号和2018年6月15日提交的美国临时申请案第62/685,424号中的每一个的优先权和权利。前述申请案中的每一个的全部内容以全文引用的方式并入本文中。序列表本申请案在此以引用的方式并有与此同时提交的电子序列表材料。电子序列表中的材料以2018年6月27日创建的标题为“20180627_LT01273_ST25.txt”的文本(.txt)文档形式提交，其文件大小是359KB并且以全文引用的方式并入本文中。
本专利技术涉及用于制备目标核酸序列的分子库的方法以及其组合物和用途。
技术实现思路
提供用于制备目标核酸序列的分子库的方法，以及其组合物和用途。方法包含使核酸样品与多个衔接子接触，所述衔接子能够在其中目标核酸经历第一扩增的条件下扩增一个或多个目标核酸序列；消化所得第一扩增产物；修复被消化...
【技术保护点】
1.一种用于制备目标核酸序列的分子库的方法，其包含：/n(a)使核酸样品与多个衔接子接触，所述衔接子能够在其中所述目标核酸经历第一扩增的条件下扩增所述样品中的一个或多个目标核酸序列；/n(b)消化所得第一扩增产物以减少或消除所得引物二聚体并制备经部分消化的目标扩增子，从而产生有间隙的双链扩增子，并进而修复所述经部分消化的目标扩增子；以及/n(c)使用通用引物在第二扩增中扩增所述经修复的目标扩增子，/n由此产生目标核酸序列的分子库；/n其中，所述多个衔接子中的每一个均包含通用固定结构序列和目标核酸序列和可裂解部分以及任选的一个或多个标签序列；并且其中包括至少两个且最多十万个目...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170630 US 62/527,893;20180106 US 62/614,362;20181.一种用于制备目标核酸序列的分子库的方法，其包含：
(a)使核酸样品与多个衔接子接触，所述衔接子能够在其中所述目标核酸经历第一扩增的条件下扩增所述样品中的一个或多个目标核酸序列；
(b)消化所得第一扩增产物以减少或消除所得引物二聚体并制备经部分消化的目标扩增子，从而产生有间隙的双链扩增子，并进而修复所述经部分消化的目标扩增子；以及
(c)使用通用引物在第二扩增中扩增所述经修复的目标扩增子，
由此产生目标核酸序列的分子库；
其中，所述多个衔接子中的每一个均包含通用固定结构序列和目标核酸序列和可裂解部分以及任选的一个或多个标签序列；并且其中包括至少两个且最多十万个目标特异性衔接子对，
其中，所述衔接子的目标核酸序列包括至少一个可裂解部分并且所述通用固定结构序列不包括所述可裂解部分。
2.根据权利要求1所述的方法，其中至少一个衔接子中包括任选的标签序列，并且所述衔接子序列中包括侧接所述标签序列的任一个末端的可裂解部分。
3.根据权利要求1所述的方法，其中每个通用序列的熔融温度高于所存在的每个目标核酸序列和每个标签序列的熔融温度。
4.根据权利要求1所述的方法，其在单一、仅添加型工作流程反应中进行，可实现高度多重化的目标分子库的快速产生。
5.根据权利要求2所述的方法，其中所有所述衔接子包含带有侧接所述标签序列的任一个末端的可裂解基团的标签序列。
6.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中步骤(b)的消化和修复是在单一步骤中进行的。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述步骤(b)的消化和修复是在不同温度下，以短暂分开的方式进行的。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法的一个或多个步骤是以手动模式或自动模式或其组合进行的。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述方法的每个步骤是以自动模式进行。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其进一步包含至少一个纯化步骤。
11.根据权利要求10所述的方法，其中纯化步骤仅在步骤(c)之后进行。
12.根据权利要求10所述的方法，其中第一纯化步骤在步骤(b)之后进行并且第二纯化步骤在步骤(c)之后进行。
13.根据权利要求10所述的方法，其中分子库由步骤(a)的所述第一扩增产生的衔接子-二聚体副产物从所得分子库中去除。
14.根据权利要求10所述的方法，其中扩增后所得的目标核酸的富集体含有数量减少的衔接子-二聚体副产物。
15.根据权利要求14所述的方法，其中衔接子-二聚体副产物全部被消除。
16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述能够扩增一个或多个目标核酸序列的多个衔接子包含能够扩增至少两个不同目标核酸序列的多个衔接子对。
17.根据权利要求2所述的方法，其中所述多个衔接子的每个目标特异性对可包括高达16,777,216个包含不同标签序列的不同衔接子组合。
18.根据权利要求17所述的方法，其中每个所产生的目标特异性扩增子序列包括至少1个不同序列且可高达107个不同序列。
19.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其进一步包含对所得目标核酸序列的分子库的序列进行分析。
20.根据权利要求19所述的方法，其中分析包含通过传统测序反应进行的测序、高通量下一代测序、靶向多重阵列序列检测或前述中的两种或更多种的任何组合。
21.根据权利要求19或权利要求20所述的方法，其进一步包含测定所述样品中的至少一个所述目标核酸序列的丰度。
22.根据权利要求20所述的方法，其中分析是通过高通量下一代测序来进行的。
23.根据权利要求22所述的方法，其中测序是以双向方式进行的，因此对于任何既定扩增子可产生正向链和反向链的序列读段。
24.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中消化试剂包含以下中的任一个或其组合：尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)、脱嘌呤核酸内切酶(例如APE1)、RecJf、甲酰胺基嘧啶[fapy]-DNA糖基化酶(fpg)、Nth核酸内切酶III、核酸内切酶VIII、聚核苷酸激酶(PNK)、TaqDNA聚合酶、DNA聚合酶I和/或人DNA聚合酶β。
25.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中修复试剂包含以下中的任一个或其组合：PhusionDNA聚合酶、PhusionUDNA聚合酶、SuperFiDNA聚合酶、TaqDNA聚合酶、人DNA聚合酶β、T4DNA聚合酶和/或T7DNA聚合酶、SuperFiUDNA聚合酶、大肠杆菌(E.coli)DNA连接酶、T3DNA连接酶、T4DNA连接酶、T7DNA连接酶、TaqDNA连接酶和/或9°NDNA连接酶。
26.根据权利要求6或权利要求7所述的方法，其中步骤(b)中的多个有间隙的聚核苷酸产物同时与所述消化和修复试剂接触，或步骤(b)中的多个有间隙的聚核苷酸产物依序与所述消化和修复试剂接触。
27.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述消化和修复试剂包含以下中的任一个或其组合：尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)、脱嘌呤核酸内切酶(例如APE1)、TaqDNA聚合酶、PhusionUDNA聚合酶、SuperFiUDNA聚合酶、7DNA连接酶。
28.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述消化和修复试剂包含以下中的任一个或其组合：尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)、甲酰胺基嘧啶[fapy]-DNA糖基化酶(fpg)、PhusionUDNA聚合酶、TaqDNA聚合酶、SuperFiUDNA聚合酶、T4PNK和T7DNA连接酶。
29.一种组合物，其包含由根据前述权利要求中任一项所述的方法产生的核酸分子库。
30.一种根据权利要求29所述的组合物的用途，其用于分析核酸分子库的序列。
31.一种用于制备目标核酸序列的分子库的方法，其包含：
(d)使核酸样品与多个衔接子接触，所述衔接子能够在其中所述目标核酸经历第一扩增的条件下扩增所述样品中的一个或多个目标核酸序列；
(e)消化所得第一扩增产物以减少或消除所得引物二聚体并制备经部分消化的目标扩增子，从而产生有间隙的双链扩增子，并进而修复所述经部分消化的目标扩增子；以及
(f)使用通用引物在第二扩增中扩增所述经修复的目标扩增子，
由此产生目标核酸序列的分子库；
其中，所述多个衔接子中的每一个均包含通用固定结构序列、一个或多个标签序列、目标核酸序列和可裂解部分；并且其中包括至少两个且可高达十万个目标特异性衔接子对；
其中，所述衔接子的目标核酸序列包括至少一个可裂解部分，所述可裂解部分侧接所述标签序列的任...
【专利技术属性】
技术研发人员：M·安德森，D·马祖尔，
申请(专利权)人：生命技术公司，
类型：发明
国别省市：美国;US
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