【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于改进编索引的核酸文库中的样品鉴定的组合物和方法相关申请本申请要求于2017年4月23日提交的美国临时专利申请第62/488,830号的权益，该美国临时专利申请在此通过引用以其整体并入本文。领域本公开内容尤其涉及对来自多个编索引的(indexed)文库的多核苷酸的测序；更特别地，涉及增加测序正确地鉴定出多核苷酸所源自的文库的可能性。背景测序方法学的改进已经允许在单一测序方案中对来自不同文库的汇集的或多重化的多核苷酸(multiplexedpolynucleotide)测序。可以将文库特异性序列(“索引标签(indextag)”)添加到每个文库的多核酸，使得可以正确地鉴定出每个被测序的多核酸的起源。可以通过例如将包含索引标签序列的衔接子连接到多核酸的末端而将索引标签序列添加到文库的多核苷酸。衔接子可以包含除索引标签序列之外的序列，诸如通用延伸引物序列和通用测序引物序列。通用延伸引物序列尤其可以与偶联到固体表面的第一寡核苷酸杂交。第一寡核苷酸可以具有游离3’末端，聚合酶可以使用杂交的文库多核苷酸作为模板从游离3’...
【技术保护点】
1.一种方法，所述方法包括：/n提供第一多于一个双链靶多核苷酸片段，每一个片段具有第一末端和第二末端；/n提供包括具有5’末端和3’末端的第一链和具有5’末端和3’末端的第二链的第一衔接子寡核苷酸，/n其中所述第一衔接子寡核苷酸包含(i)双链区域，所述双链区域包含所述第一链的5’末端和所述第二链的3’末端，和(ii)单链区域，在所述单链区域中所述第一链和所述第二链是单链的，其中所述单链区域包含所述第一链的3’末端和所述第二链的5’末端，/n其中所述第一衔接子寡核苷酸包含第一文库特异性序列，/n其中所述第一链的3’末端被修饰以防止被具有3’外切核酸酶活性的酶消化，并且其中所述...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170423 US 62/488,8301.一种方法，所述方法包括：
提供第一多于一个双链靶多核苷酸片段，每一个片段具有第一末端和第二末端；
提供包括具有5’末端和3’末端的第一链和具有5’末端和3’末端的第二链的第一衔接子寡核苷酸，
其中所述第一衔接子寡核苷酸包含(i)双链区域，所述双链区域包含所述第一链的5’末端和所述第二链的3’末端，和(ii)单链区域，在所述单链区域中所述第一链和所述第二链是单链的，其中所述单链区域包含所述第一链的3’末端和所述第二链的5’末端，
其中所述第一衔接子寡核苷酸包含第一文库特异性序列，
其中所述第一链的3’末端被修饰以防止被具有3’外切核酸酶活性的酶消化，并且其中所述第二链的5’末端被修饰以防止被具有5’外切核酸酶活性的酶消化；
将所述第一衔接子寡核苷酸和所述第一多于一个双链靶多核苷酸片段在适于将所述第一衔接子的第一链的5’末端和所述第一衔接子的第二链的3’末端连接至所述双链靶多核苷酸片段的第一末端和第二末端的条件下孵育，以产生包含第一衔接子-靶-第一衔接子序列的多核苷酸的第一文库；和
将所述第一文库的多核苷酸与外切核酸酶接触，其中所述外切核酸酶包括3’单链外切核酸酶活性和5’单链外切核酸酶活性，以选择性降解未连接至所述双链靶多核苷酸片段的第一衔接子寡核苷酸。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述外切核酸酶包括针对没有切口的双链DNA的活性，以降解两个末端未与所述第一衔接子寡核苷酸连接的双链靶多核苷酸片段。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，
其中所述第一衔接子的第一链的3’末端包含硫代磷酸酯键，其中单链DNA结合蛋白与所述第一衔接子的第一链的3’末端结合，其中生物素被附接至所述第一衔接子的第一链的3’末端，或其中抗体被附接至所述第一衔接子的第一链的3’末端；并且
其中所述第一衔接子的第二链的5’末端包含硫代磷酸酯键，其中单链DNA结合蛋白与所述第一衔接子的第二链的5’末端结合，其中生物素被附接至所述第一衔接子的第二链的5’末端，或其中抗体被附接至所述衔接子的第二链的5’末端。
4.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述第一衔接子的第一链的3’末端包含三个硫代磷酸酯键，并且其中所述第一衔接子的第二链的5’末端包含三个硫代磷酸酯键。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述第一文库的多核苷酸的被纯化。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，所述方法还包括：
提供基底，所述基底具有包含多于一个附接的寡核苷酸的表面，所述附接的寡核苷酸具有游离3’末端；和
将所述基底的所述表面与包含纯化的第一文库的多核苷酸的组合物在允许所述第一衔接子-靶-第一衔接子序列的第一衔接子的一条链的一部分与附接至所述基底的所述表面的寡核苷酸的至少一部分杂交的条件下接触。
7.根据权利要求6所述的方法，所述方法还包括通过掺入与杂交到与所述基底的所述表面附接的寡核苷酸的所述第一衔接子-靶-第一衔接子多核苷酸的序列互补的核苷酸，使所述附接的寡核苷酸从所述游离3’末端延伸，以产生杂交的第一文库多核苷酸的拷贝使得所述拷贝被附接至所述基底的所述表面。
8.根据权利要求7所述的方法，所述方法还包括扩增附接至所述基底的所述表面的所述拷贝。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述方法还包括：
提供第二多于一个双链靶多核苷酸片段，每一个片段具有第一末端和第二末端；
提供包括具有5’末端和3’末端的第一链和具有5’末端和3’末端的第二链的第二衔接子寡核苷酸，
其中所述第二衔接子寡核苷酸包含(i)双链区域，所述双链区域包含所述第一链的5’末端和所述第二链的3’末端，和(ii)单链区域，所述单链区域包含所述第一链的3’末端和所述第二链的5’末端，
其中所述第一链的3’末端被修饰以防止被具有3’外切核酸酶活性的酶消化，并且其中所述第二链的5’末端被修饰以防止被具有5’外切核酸酶活性的酶消化；
其中所述第二衔接子包含与所述第一文库特异性序列不同的第二文库特异性序列；
将所述第二衔接子寡核苷酸和所述第二多于一个双链靶多核苷酸片段在适于将所述第二衔接子的第一链的5’末端和所述第二衔接子的第二链的3’末端连接至所述双链靶多核苷酸片段的第一末端和第二末端的条件下孵育，以产生包含第二衔接子-靶-第二衔接子序列的多核苷酸的第二文库；和
将所述第二文库的多核苷酸与外切核酸酶接触，其中所述外切核酸酶包括3’单链外切核酸酶活性和5’单链外切核酸酶活性，以选择性降解未连接至所述双链靶多核苷酸片段的第二衔接子寡核苷酸。
10.根据权利要求9所述的方法，其中与所述第二文库的多核苷酸接触的所述外切核酸酶包括针对没有切口的双链DNA的活性，以降解两个末端未与所述第二衔接子寡核苷酸连接的所述双链靶多核苷酸片段。
11.根据权利要求9或权利要求10所述的方法，
其中所述第二衔接子的第一链的3’末端包含硫代磷酸酯键，其中单链DNA结合蛋白与所述第二衔接子的第一链的3’末端结合，其中生物素被附接至所述第二衔接子的第一链的3’末端，或其中抗体与所述第二衔接子的第一链的3’末端结合；并且
其中所述第二衔接子的第二链的5’末端包含硫代磷酸酯键，其中单链DNA结合蛋白与所述第二衔接子的第二链的5’末端结合，或其中生物素被附接至所述第二衔接子的第二链的5’末端，或其中抗体与所述第二衔接子的第二链的5’末端结合。
12.根据权利要求9或权利要求10所述的方法，其中所述第二衔接子的第一链的3’末端包含三个硫代磷酸酯键，并且其中所述第二衔接子的第二链的5’末端包含三个硫代磷酸酯键。
13.根据权利要求9至12中任一项所述的方...
【专利技术属性】
技术研发人员：E·H·弗马斯，马哈迪耶·霍斯鲁海达里，安吉拉·卡尔班德，
申请(专利权)人：伊鲁米那股份有限公司，伊鲁米纳剑桥有限公司，
类型：发明
国别省市：美国;US
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