【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】工程化且完全-功能定制的糖蛋白1.相关申请的交叉引用本专利技术申请主张2017年6月30日提交的美国临时专利申请No.62/527,466的优先权益，该专利申请的全部内容作为参考并入本文。2.序列表本专利技术申请包含以ASCII格式提交并且以其全部内容作为参考并入本文的序列表。2018年6月28日创建的所述ASCII拷贝的名称为14197-005-228_ST25_FINAL.txt并且大小为1,065,529字节。3.
本文描述了体外和体内产生糖基化蛋白的组合物和方法。所述方法包括使用宿主细胞来产生糖基化蛋白。本文还描述了使用这些方法产生的糖基化蛋白及其用途。4.
技术介绍
蛋白糖基化是所有生命领域中普遍存在的翻译后修饰。在动物系统中存在巨大的复杂性，并且聚糖结构具有重要的生物和生理学作用，从在蛋白折叠和质量、控制中的贡献到在大量生物事件，如这些分子的识别、稳定性、作用和周转中的参与(Moremen等人,2012)。治疗性糖蛋白，如单克隆抗体、酶和激素是生物技术工业中的主要产品(Lagass...
【技术保护点】
1.利什曼虫(Leishmania)宿主细胞，其包含：/na.编码靶标蛋白的重组核酸；和/nb.编码异源糖基转移酶的重组核酸。/n
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170630 US 62/527,4661.利什曼虫(Leishmania)宿主细胞，其包含：
a.编码靶标蛋白的重组核酸；和
b.编码异源糖基转移酶的重组核酸。
2.根据权利要求1所述的宿主细胞，其中所述异源糖基转移酶是N-乙酰氨基葡萄糖转移酶；和/或异源半乳糖基转移酶；和/或异源唾液酸转移酶。
3.根据权利要求2所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞包含两种或更多种N-乙酰氨基葡萄糖转移酶；和/或两种或更多种异源半乳糖基转移酶；和/或两种或更多种异源唾液酸转移酶。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的宿主细胞，其中所述包含异源唾液酸转移酶的宿主细胞还包含能够产生CMP-NeuAc的异源CMP-Sia生物合成途径蛋白。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的宿主细胞，其中来自N-聚糖生物合成途径的一种或多种内源酶已缺失、突变和/或功能性失活。
6.根据权利要求1至4中任一项所述的宿主细胞，其中所述利什曼虫(Leishmania)细胞是蜥蜴利什曼虫(Leishmaniatarentolae)细胞。
7.根据权利要求2至6中任一项所述的宿主细胞，其中所述N-乙酰氨基葡萄糖转移酶、半乳糖基转移酶和/或唾液酸转移酶的氨基酸序列来源于表9中所列的N-乙酰氨基葡萄糖转移酶、半乳糖基转移酶或唾液酸转移酶，或其功能同源物、同工型或变体。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的宿主细胞，其中将利什曼虫(Leishmania)信号和/或保留序列加入至所述N-乙酰氨基葡萄糖转移酶、半乳糖基转移酶和/或唾液酸转移酶，其中所述信号序列将所述N-乙酰氨基葡萄糖转移酶、半乳糖基转移酶和/或唾液酸转移酶靶向利什曼虫(Leishmania)宿主细胞的内质网，并且其中所述保留序列将所述N-乙酰氨基葡萄糖转移酶、半乳糖基转移酶和/或唾液酸转移酶保留在高尔基体中。
9.根据权利要求4至8中任一项所述的宿主细胞，其中所述能够产生CMP-NeuAc的CMP-Sia生物合成途径蛋白与表11中所列的CMP-Sia生物合成途径蛋白至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一或是其任何功能同源物、同工型或变体。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的宿主细胞，其中所述N-乙酰氨基葡萄糖转移酶是GnT-I。
11.根据权利要求1至9中任一项所述的宿主细胞，其中所述N-乙酰氨基葡萄糖转移酶是GnT-II。
12.根据权利要求1至9中任一项所述的宿主细胞，其中所述N-乙酰氨基葡萄糖转移酶是GnT-I和GnT-II。
13.根据权利要求1至9中任一项所述的宿主细胞，其中所述半乳糖基转移酶是B4GALT1。
14.根据权利要求1至9中任一项所述的宿主细胞，其中所述N-乙酰氨基葡萄糖转移酶是GnT-I和GnT-II，并且所述半乳糖基转移酶是B4GALT1。
15.根据权利要求1至9中任一项所述的宿主细胞，其中所述唾液酸转移酶是2,6-SiaT或者2,3-SiaT。
16.根据权利要求1至9中任一项所述的宿主细胞，其中所述N-乙酰氨基葡萄糖转移酶是GnT-I和GnT-II，所述半乳糖基转移酶是B4GALT1，并且所述唾液酸转移酶是2,6-SiaT或2,3-SiaT。
17.根据权利要求1至9中任一项所述的宿主细胞，其中所述N-乙酰氨基葡萄糖转移酶是GnT-I和GnT-II，所述半乳糖基转移酶是B4GALT1，并且所述唾液酸转移酶是2,6-SiaT或2,3-SiaT，并且其中所述唾液酸转移酶还包含能够产生CMP-NeuAc的异源CMP-Sia生物合成途径蛋白。
18.根据权利要求8所述的宿主细胞，其中所述保留序列将所述N-乙酰氨基葡萄糖转移酶和/或半乳糖基转移酶保留在宿主细胞的高尔基体区室的顺面膜囊中。
19.根据权利要求8所述的宿主细胞，其中所述保留序列将所述N-乙酰氨基葡萄糖转移酶和/或半乳糖基转移酶保留在宿主细胞的高尔基体区室的中间膜囊中。
20.根据权利要求8所述的宿主细胞，其中所述保留序列将所述半乳糖基转移酶保留在宿主细胞的高尔基体区室的反面膜囊中。
21.根据权利要求8所述的宿主细胞，其中所述保留序列将所述唾液酸转移酶保留在宿主细胞的高尔基体区室的反面膜囊中。
22.根据权利要求8所述的宿主细胞，其中所述保留序列将所述唾液酸转移酶和半乳糖基转移酶保留在宿主细胞的高尔基体区室的反面膜囊中。
23.根据权利要求8或10至22中任一项所述的宿主细胞，其中所述信号序列和/或保留序列是来源于蜥蜴利什曼虫(Leishmaniatarentolae)的信号序列或保留序列。
24.根据权利要求23所述的宿主细胞，其中加工并除去所述信号序列。
25.根据权利要求8或10至23中任一项所述的宿主细胞，其中所述保留序列是来源于蜥蜴利什曼虫(Leishmaniatarentolae)蛋白的胞质-跨膜-干(CTS)序列。
26.根据权利要求25所述的宿主细胞，其中所述CTS序列来源于蜥蜴利什曼虫(Leishmaniatarentolae)MAN1、NTPDase1或NTPDase2。
27.根据权利要求25所述的宿主细胞，其中所述CTS序列包含SEQIDNO：24、SEQIDNO：25或SEQIDNO：26所示的序列或其功能活性片段。
28.根据权利要求25所述的宿主细胞，其中所述CTS序列包含与SEQIDNO：24所示的序列具有至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的序列或其功能活性片段；与SEQIDNO：25所示的序列具有至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的序列或其功能活性片段；或者与SEQIDNO：26所示的序列具有至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的序列或其功能活性片段。
29.根据权利要求25所述的宿主细胞，其中所述CTS来源于蜥蜴利什曼虫(Leishmaniatarentolae)MAN1。
30.根据权利要求25所述的宿主细胞，其中所述CTS序列包含SEQIDNO：24所示的序列或其功能活性片段。
31.根据权利要求20至22中任一项所述的宿主细胞，其中所述保留序列包含来源于利什曼虫(Leishmania)的GRIP序列或其功能活性片段。
32.根据权利要求31所述的宿主细胞，其中所述GRIP序列包含SEQIDNO：27所示的序列或其功能活性片段。
33.根据权利要求31所述的宿主细胞，其中所述GRIP序列包含与SEQIDNO：27所示的序列具有至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列或其功能活性片段。
34.根据权利要求20至22中任一项所述的宿主细胞，其中所述保留序列包含来源于利什曼虫(Leishmania)蛋白的CTS序列或其功能活性片段，和来源于利什曼虫(Leishmania)的GRIP序列或其功能活性片段。
35.根据权利要求34所述的宿主细胞，其中所述CTS序列来源于蜥蜴利什曼虫(Leishmaniatarentolae)MAN1、NTPDase1或NTPDase2。
36.根据权利要求34所述的宿主细胞，其中所述CTS序列包含SEQIDNO：24、SEQIDNO：25或SEQIDNO：26所示的序列，并且GRIP序列包含SEQIDNO：27所示的序列，或其功能活性片段。
37.根据权利要求34所述的宿主细胞，其中所述CTS序列来源于蜥蜴利什曼虫(Leishmaniatarentolae)MAN1。
38.根据权利要求34所述的宿主细胞，其中所述CTS序列包含SEQIDNO：24所示的序列，并且GRIP序列包含SEQIDNO：27所示的序列，或其功能活性片段。
39.根据权利要求1至38中任一项所述的宿主细胞，其中所述靶标蛋白对于利什曼虫(Leishmania)宿主细胞是异源的。
40.根据权利要求39所述的宿主细胞，其中所述靶标蛋白已工程化以包含来自利什曼虫(Leishmania)的信号序列。
41.根据权利要求40所述的宿主细胞，其中所述来自利什曼虫(Leishmania)的信号序列是来自蜥蜴利什曼虫(Leishmaniatarentolae)的信号序列。
42.根据权利要求39所述的宿主细胞，其中所述信号序列包含SEQIDNO：28或SEQIDNO：29所示的序列或其功能活性片段。
43.根据权利要求39所述的宿主细胞，其中所述信号序列包含SEQIDNO：28所示的序列或其功能活性片段。
44.根据权利要求39所述的宿主细胞，其中所述信号序列包含与SEQIDNO：28所示的信号序列具有至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的信号序列或其功能活性片段。
45.根据权利要求41至44中任一项所述的宿主细胞，其中加工所述信号序列并将其从所述靶标蛋白中除去。
46.根据权利要求39至45中任一项所述的宿主细胞，其中所述靶标蛋白包含以下的氨基酸序列：人干扰素-α(INF-α)、干扰素-β(INF-β)、干扰素-γ(INF-γ)、白介素-2(IL2)、嵌合白喉毒素-IL-2(Denileukindiftitox)、白介素-1(IL1)、IL1B、IL3、IL4、IL11、IL21、IL22、IL1受体拮抗剂(阿那白滞素)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、胰岛素、普兰林肽、生长激素(GH)、胰岛素样生长因子(IGF1)、人甲状旁腺激素、降钙素、高血糖素-样肽-1激动剂(GLP-1)、高血糖素、生长激素-释放激素(GHRH)、胰泌素、促甲状腺激素(TSH)、人骨形态发生蛋白2(hBMP2)、人骨形态发生蛋白7(hBMP7)、促性腺激素释放激素(GnRH)、角化细胞生长因子(KGF)、血小板源性生长因子(PDGF)、成纤维细胞生长因子7(FGF7)、成纤维细胞生长因子20(FGF20)、成纤维细胞生长因子21(FGF21)、表皮生长因子(EGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、神经营养蛋白-3、人促生育素(FSH)、人绒毛膜促性腺激素(HCG)、促黄体素-α、促红细胞生成素、粒性白细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、CTLA4的胞外域(例如，FC-融合蛋白)或者TNF受体的胞外域(例如，FC-融合蛋白)。
47.根据权利要求39至45中任一项所述的宿主细胞，其中所述靶标蛋白是治疗性蛋白。
48.根据权利要求39至45中任一项所述的宿主细胞，其中所述靶标蛋白是抗体。
49.根据权利要求48所述的宿主细胞，其中所述抗体是抗人蛋白抗体。
50.根据权利要求48或49所述的宿主细胞，其中所述抗体具有阿达木单抗(Humira)；类克(Remicade)(英利昔单抗)；ReoPro(阿昔单抗)；Rituxan(利妥昔单抗)；舒莱(巴利昔单抗)；Synagis(帕利珠单抗)；赫塞汀(曲妥珠单抗)；麦罗塔(吉妥珠单抗奥唑米星)；Campath(阿仑珠单抗)；Zevalin(替伊莫单抗替坦(tiuxetan))；索雷尔(奥马珠单抗)；百克沙(托西莫单抗-I-131)；爱必妥(西妥昔单抗)；安维汀(贝伐单抗)；Tysabri(那他珠单抗)；Actemra(托珠单抗)；维克替比(帕尼单抗)；Lucentis(兰尼单抗(ranibizumab))；Soliris(依库珠单抗)；Cimzia(聚乙二醇结合赛妥珠单抗(Certolizumabpegol))；Simponi(戈利木单抗)；Ilaris(卡那津单抗)；Stelara(优特克单抗)；Arzerra(奥法木单抗)；Prolia(地诺单抗)；Numax(莫维珠单抗)；ABThrax(瑞西巴库单抗)；Benlysta(贝利木单抗)；Yervoy(普利木单抗)；Adcetris(本妥昔单抗)；Perjeta(帕妥珠单抗)；Kadcyla(曲妥珠单抗-美坦新偶联物(Ado-trastuzumabemtansine))；或者Gazyva(奥比妥珠单抗)的氨基酸序列。
51.根据权利要求48至50中任一项所述的宿主细胞，其中所述抗体是全长抗体、Fab、F(ab')2、scFv或sdAb。
52.根据权利要求39至45中任一项所述的宿主细胞，其中所述靶标蛋白包含酶或其抑制剂的氨基酸序列。
53.根据权利要求52所述的宿主细胞，其中所述靶标蛋白包含以下的氨基酸序列：凝血因子VII、凝血因子VIII、凝血因子IX、凝血因子X、凝血因子XIII、凝血因子VIIa、抗凝血酶III(AT-III)、蛋白C、组织纤维蛋白溶酶原活化因子(tPA)和tPA变体、尿激酶、水蛭素、链激酶、葡糖脑苷脂酶、阿葡糖苷酶-α、拉罗尼酶(α-L-艾杜糖醛酸酶)、艾杜硫酶(艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶)、加硫酯酶、半乳糖苷酶-β(人α-半乳糖苷酶A)、肉毒毒素、胶原酶、人脱氧核糖核酸酶-I、玻璃酸酶、木瓜蛋白酶、天冬酰胺酶、尿酸酶(尿酸氧化酶)、谷氨酸羧肽酶(谷卡匹酶)、α1蛋白酶抑制剂(α1抗胰蛋白酶)、乳糖酶、胰酶(脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶)和腺苷脱氨酶。
54.根据权利要求47所述的宿主细胞，其中所述治疗剂蛋白包含以下的氨基酸序列阿巴西普(例如，奥瑞希纳)、阿柏西普(例如，艾力亚)、β半乳糖苷酶(例如，Fabrazyme)、阿必鲁泰(例如，Eperzan)、阿地白介素(例如，Proleukin)、阿法西普(例如，阿密凡夫)、阿糖脑苷酶(例如，Ceredase)、α阿葡糖苷酶(例如，LUMIZYME)、阿利吉仑(例如，泰克特纳)、α-1-蛋白酶抑制因子(例如，Aralast)、阿替普酶(例如，Activase)、阿那白滞素(例如，Kineret)、阿尼普酶(例如，Eminase)、人炭疽免疫球蛋白(例如，ANTHRASIL)、抗血友病因子(例如，百因止)、抗抑制剂混凝剂复合物(例如，FeibaNf)、抗凝血酶α、人抗凝血酶III、抗胸腺细胞球蛋白(例如，抗胸腺细胞球蛋白)、抗-胸腺细胞球蛋白(马)(例如，ATGAM)、抗-胸腺细胞球蛋白(兔)(例如，ATG-Fresenius)、抑肽酶(例如，特斯乐)、Asfotaseα、门冬酰胺酶(例如，爱施巴)、菊疫病欧文氏菌(erwiniachrysanthemi)门冬酰胺酶(例如，Erwinaze)、贝卡普勒明(例如，REGRANEX)、贝拉西普(belatacept)(例如，Nulojix)、贝拉克坦、比伐卢定(例如，Angiomax)、A型肉毒毒素(例如，保妥适)、B型肉毒毒素(例如，Myobloc)、本妥昔单抗(例如，Adcetris)、布舍瑞林(例如，Suprecur)、C1酯酶抑制剂(人)、C1酯酶抑制剂(重组)(例如，Ruconest)、聚乙二醇结合赛妥珠单抗(Certolizumabpegol)(例如，Cimzia)、绒促性素α(例如，绒促性素α)、绒毛膜促性腺激素(人)(例如，艾泽(Ovidrel))、绒毛膜促性腺激素(重组)(例如，Ovitrelle)、凝血因子ix(例如，Alprolix)、凝血因子VIIa(例如，诺其(NovoSeven))、人凝血因子X(例如，Coagadex)、凝血因子XIIIA-亚基(重组)、胶原酶(例如，Cordase)、Conestatα、促肾上腺皮质激素(例如，H.P.Acthar)、替可克肽(例如，Cortrosyn)、达贝泊汀α(例如，安然爱斯普(Aranesp))、去纤苷(例如，Noravid)、地尼白介素-毒素连接物(denileukindiftitox)(例如，Ontak)、地西卢定、地高辛免疫Fab(羊)(例如，DIGIBIND)、阿法链道酶(例如，百慕时(Pulmozyme))、屈曲可近α(例如，Xigris)、度拉糖肽、艾莫凝血素α(例如，ELOCTA)、依洛硫酸酯酶α、恩夫韦地(例如，FUZEON)、阿法依伯汀(例如，Binocrit)、依泊汀zeta(例如，Retacrit)、依替巴肽(例如，INTEGRILIN)、依那西普(例如，恩利(Enbrel))、艾塞那肽(例如，百泌达(Byetta))、因子IX复合物(人)(例如，AlphaNine)、纤溶酶，也称为胞浆素(例如，Elase)、非格司亭(例如，N.A.)、非格司亭-sndz、促卵泡素α(例如，Gonal-F)、促滤泡素β(例如，FollistimAQ)、加硫酶(例如，Naglazyme)、胃内因子、吉妥珠单抗奥唑米星(例如，麦罗塔)、醋酸格拉替雷(例如，克帕松(Copaxone))、重组高血糖素(例如，诺和生(GlucaGen))、谷卡匹酶(例如，Voraxaze)、短杆菌肽D(例如，新斯波林(Neosporin))、乙型肝炎免疫球蛋白、人降钙素、人破伤风梭菌(clostridiumtetani)类毒素免疫球蛋白、人狂犬病病毒免疫球蛋白(例如，HyperabRabies人免疫球蛋白)、人Rho(D)免疫球蛋白(例如，HypRhoDInj16.5％)、人血清白蛋白(例如，亚玛(Albuminar))、人水痘-带状疱疹免疫球蛋白(例如，Varizig)、玻璃酸酶(例如，HYLENEX)、玻璃酸酶(人重组)、替伊莫单抗替坦(tiuxetan)(例如，泽瓦林(Zevalin))、艾杜硫酶(例如，Elaprase)、伊米苷酶(例如，思而赞(Cerezyme))、人免疫球蛋白、门冬胰岛素(例如，NovoLog)、牛胰岛素、德谷胰岛素(例如，诺和达(Tresiba))、地特胰岛素(例如，诺和平(LEVEMIR))、甘精胰岛素(例如，来得时(Lantus))、赖谷胰岛素(例如，艾倍得(APIDRA))、赖脯胰岛素(例如，优泌乐(Humalog))、猪胰岛素(例如，IletinII)、普通胰岛素(例如，常规优泌林(HumulinR))、猪胰岛素(例如，vetsulin)、低精蛋白胰岛素(例如，诺和灵N(NovolinN))、重组干扰素α-2a(例如，罗扰素(Roferon)A)、干扰素α-2b(例...
【专利技术属性】
技术研发人员：阿米尔礼萨·法里德莫亚耶，曼纽拉·玛莉，瑞纳·福拉多尔，
申请(专利权)人：利玛泰克生物制品公司，
类型：发明
国别省市：瑞士;CH
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