缀合度受控的生物缀合物、其制备方法及制备其的试剂技术

本发明专利技术涉及一种制备具有确定的缀合度(1‑8)的蛋白质缀合物的异质单分散混合物的方法，所述蛋白质缀合物通过使用允许亲和浓缩后进行随后的同时释放‑官能化的三官能试剂来获得。

Conjugates with controlled degree of conjugation, their preparation methods and reagents

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】缀合度受控的生物缀合物、其制备方法及制备其的试剂本专利技术涉及生物缀合剂领域，例如抗体缀合物，其中抗体与一个或多个官能实体(本文称为“有效载荷(payload)”)，特别是抗体药物缀合物(ADC)缀合。ADC是发展最快的一类肿瘤治疗剂，因此一直受到广泛关注。本妥昔单抗-维多汀和曲妥珠单抗-美坦新的批准为正在进行的临床试验铺平了道路。实际上，当前正在开发许多ADC候选物，预计大量处于后期临床阶段的ADC将作为不同物质的混合物而商业化。当前开发的ADC实际上是不同物质的混合物，这意味着药物抗体比(DAR，也称为缀合度或DoC)遵循在样品内的二项式分布。换句话说，与抗体缀合的药物数量既不受控制也不确定，通常仅考虑平均药物数量。据报道，ADC设计的主要挑战之一是ADC分子的均质性。上面提到的两个已获批准的ADC和正在开发的大多数ADC在以下方面是异质的，通常每个抗体中它们具有0至8个药物分子(平均DAR为3至4)，并且据报道这可能会对缀合的药物的药代动力学、药效动力学、体内性能/效率和/或治疗窗口(副作用)产生不利影响(BioconjugateChemi本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种式(D-n)的区域异构DAR特异性蛋白质缀合物的混合物：/n蛋白质-(G)

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170706 EP 17305879.31.一种式(D-n)的区域异构DAR特异性蛋白质缀合物的混合物：
蛋白质-(G)n
(D-n)
其中，
n表示总缀合度(DoC)，并且为1至8的整数；
蛋白质是天然蛋白质或合成蛋白质或其片段；
(G)指在相同或不同的连接位点接枝到蛋白质上的相同或不同的缀合物片段，
条件是每个片段(G)具有各自的为1至8的缀合度i，其中∑(i)＝n
并且其中，每个片段(G)具有下式：
-Y-(Z1)p-P-(Z3)s-F
(G)
条件是每个(G)的Y、Z1、P、Z3、F、n、p和s各自相同或不同，并且在n大于1的情况下，(D-n)中的(G)片段可以相同或不同
所述混合物的特征在于，对于给定的缀合物片段(G)：
-存在限定的各自的缀合度(DoC)i；
-所述混合物包含具有所述片段(G)的缀合物，使得至少90％的所述缀合物具有限定的各自的DoCi；
p和s独立地为0或1；
Z1和Z3是独立地选自由以下组成的组中的任选的间隔单元：C6-C12亚芳基；直链或支链的饱和或不饱和的C1-C60亚烷基，其任选地被选自-O-、-S-、-S(O)-、-SO2-、-O-P(O)(OH)-O-、-C(O)-、-NH-、-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)NR4-、-NR4C(O)-、杂亚芳基、亚芳基、单环或双环(C3-C10)亚环烷基、糖基、-O-(CH2-CH2-O-)r-、-NH-(CH2-CH2-O-)r-、-(-O-CH2-CH2-)r或-(CH2-CH2-O-)r-基团中的一个或多个化学基团中断和/或终止；和氨基酸或肽残基，其中环可以任选地是稠合的；
其中r为1至24的整数，并且
其中R4是选自由C1-C6亚烷基组成的组中的溶解单元，其中一个或多个H被以下片段中的任一个取代：



P是由两个互补的转标记官能团T和C反应产生的转标记单元，P优选选自：



F是选自诸如抗肿瘤剂的药物；寡核苷酸；或检测剂的功能剂；
X是H或卤素原子(F、Cl、Br、I)；
Y是在水性条件下由R与蛋白质中存在的氨基酸残基反应生成的化学残基，优选选自由以下组成的组：





2.权利要求1所述的蛋白质缀合物(D-n)的混合物，其中，所述混合物包含DoC为1的具有式(D-1)的蛋白质缀合物：
蛋白质-Y-(Z1)p-P-(Z3)s-F
(D-1)
其中，蛋白质、Y、Z1、P、Z3、F、p和s如权利要求1所定义，并且其中，所述缀合物具有式(G)的缀合物片段：
Y-(Z1)p-P-(Z3)s-F
(G)
并且包含至少90％的缀合物(D-1)，所述片段接枝在蛋白质的相同或不同的连接位点上。


3.权利要求1或2所述的蛋白质缀合物(D-n)的混合物，其中，所述药物选自细胞毒性药物和抗肿瘤剂。


4.权利要求1至3中任一项所述的式(D-n)的蛋白质缀合物的混合物，其中，所述蛋白质是单克隆抗体。


5.一种制备根据权利要求1至5中任一项所述的蛋白质缀合物(D-n)的混合物的方法：
蛋白质-(Y-(Z1)p-P-(Z3)s-F)n
(D-n)
包括以下步骤：
i)使蛋白质与式(I)的试剂以低转化率反应，以产生式(E-1)的缀合物：
R-(Z1)p-T-(Z2)q-A
(I)
其中：
蛋白质如上定义；
R是在水性条件下对蛋白质中存在的氨基酸残基具有反应性的化学官能团；
Z1和Z2是独立地选自由以下组成的组中的任选的间隔单元：C6-C12亚芳基；直链或支链的饱和或不饱和的C1-C60亚烷基，其任选地被选自-O-、-S-、-S(O)-、-SO2-、-O-P(O)(OH)-O-、-C(O)-、-NH-、-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)NR4-、-NR4C(O)-、杂亚芳基、亚芳基、糖基、-O-(CH2-CH2-O-)r-、-NH-(CH2-CH2-O-)r-、-(-O-CH2-CH2-)r或-(CH2-CH2-O-)r-基团中的一个或多个化学基团中断和/或终止；和氨基酸或肽残基；
其中r为1至24的整数，并且
其中R4是选自由C1-C6亚烷基组成的组中的溶解单元，其中一个或多个H被以下片段中的任一个取代：



p和q独立地为0或1；
A是适合于将式(I)的化合物固定在亲和固相上的亲和单元；
T是转标记单元优选地选自由以下组成的组：



其中X选自H、F、Cl、Br、I，且R'选自-H；饱和或不饱和的C1-C60烷基，其任选地被选自-O-、-S-、-S(O)-、-SO2-、-O-P(O)(OH)-O-、-C(O)-、-NH-、-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)NR4-、-NR4C(O)-、杂亚芳基、亚芳基、糖基、-O-(CH2-CH2-O-)r或-NH-(CH2-CH2-O-)r基团中的一个或多个化学基团中断，其中r为1至24的整数；以及氨基酸或肽残基，
蛋白质Y-(Z1)p-T-(Z2)q-A
(E-1)
其中，蛋白质、Y、Z1、T、Z2、A、p和q如上定义；
ii)将式(E-1)的缀合物负载在包含所述亲和固相的亲和柱(B)上；
iii)任选地将步骤i)中未反应的蛋白质再循环到步骤i)中；
iv)使负载有式(E-1)的缀合物的亲和柱(B)与式(II)的转标记试剂进行转标记反应，从而同时形成亲和柱并从亲和柱中释放式(D’-1)的缀合物：

【专利技术属性】
技术研发人员：谢尔盖·科洛迪赫，奥列克桑德·科涅夫，阿兰·瓦格纳，伊戈尔·多夫甘，
申请(专利权)人：国家科学研究中心，斯特拉斯堡大学，辛迪维亚公司，
类型：发明
国别省市：法国;FR