一种基于葡聚糖信号放大的p16制造技术

本发明专利技术提供一种基于葡聚糖信号放大的p16

P16 based on dextran signal amplification

【技术实现步骤摘要】
一种基于葡聚糖信号放大的p16INK4a化学发光试剂盒
本专利技术涉及生物化学检测领域，尤其涉及一种基于葡聚糖信号放大的p16INK4a化学发光试剂盒。
技术介绍
p16INK4a基因又叫MTS(multipletumorsuppressor1)基因，是1994年美国冷泉港实验室Kamb等发现的新抗癌基因，这是一种细胞周期中的基本基因，直接参与细胞周期的调控，负调节细胞增殖及分裂，在人类50％肿瘤细胞株纯发现有纯合子缺失，突变，认为p16INK4a是比p53更重要的一种新型抗癌基因。有人把它比作细胞周期中的刹车装置，一旦失灵则会导致细胞恶性增殖，导致恶性肿瘤发生。p16INK4a基因已经在肺癌、乳腺癌、脑肿瘤、骨肿瘤、皮肤癌、膀胱癌、肾癌、卵巢癌和淋巴瘤、黑色素瘤中发现纯合子缺失以及无义、错义及移码突变，表明p16INK4a基因以缺失、突变方式广泛参与肿瘤形成，检测p16INK4a基因有无改变对判断患者肿瘤的易感性以及预测肿瘤的预后，具有十分重要的临床意义。化学发光免疫分析(CLIA)是将具有高灵敏度的化学发光测定技术与高特异性的免疫反应相结合，用于各种抗原、半抗原、抗体、激素、酶、脂肪酸、维生素和药物等的检测分析技术。是继放免分析、酶免分析、荧光免疫分析之后发展起来的一项免疫测定技术。CLIA与其它传统的标记技术相比有以下优点：第一，检测过程无放射性辐射，不会对人体有危害；第二，拥有较高的灵敏度和较宽的线性范围；第三，一般采用自动化仪器进行操作，无需专业操作人员，排除人为操作干扰，稳定性好；第四，该方法学应用场景广，可检测不同分子大小的抗原、半抗原和抗体，又可以用于核酸探针的检测。目前国内大部分在使用进口厂家的试剂，如罗氏、雅培、贝克曼等。现有p16INK4a检测方法主要是免疫组织化学法，只能定性染色无法定量检测，ELISA检测试剂盒的定量分析受p16INK4a在细胞内表达水平和样本为脱落细胞的影响，对检测的灵敏度要求极高，容易出现漏检，所以亟需一种具有高灵敏度的p16INK4a检测试剂盒。
技术实现思路
本专利技术的目的在于，提供一种抗体使用量更少，干扰更低，且具有极高灵敏度的基于葡聚糖信号放大的p16INK4a化学发光试剂盒。为了实现上述目的，本专利技术提供了一种基于葡聚糖信号放大的p16INK4a化学发光试剂盒，所述试剂盒包括p16INK4a校准品，p16INK4a抗体磁珠，吖啶酯标记葡聚糖多聚p16INK4a抗体，缓冲液，稀释缓冲液以及洗涤液；所述吖啶酯标记葡聚糖多聚p16INK4a抗体的制备方法为活化后的吖啶酯与活化后的葡聚糖和p16INK4a抗体三者偶联，封闭，洗涤，保存。具体包括：(1)葡聚糖活化：将葡聚糖(DeX)溶于磷酸盐缓冲溶液(PBS)中，加入适量高碘酸钠(NaIO4)进行氧化，用葡聚糖基质相同磷酸盐缓冲溶液进行透析过夜；(2)吖啶酯活化：加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)旋涡混合，再加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)旋涡混合；摇床100-500r/min，30-37℃反应10-30min；其中NHS:EDC的质量浓度比为25:10；(3)偶联：离心后去除上清，加入超纯水，超声复溶，重复离心复溶，加入p16INK4a单克隆抗体和活化葡聚糖，旋涡混合，摇床100-500r/min，30-37℃反应1-3h；(4)封闭，洗涤，保存。作为一个优选方案，所述p16INK4a抗体磁珠的制备方法为磁珠活化后与抗p16INK4a单克隆抗体偶联，封闭，洗涤，保存。具体包括：(1)免疫磁珠的活化：加入NHS旋涡混合，再加入EDC旋涡混合；摇床100-500r/min，30-37℃反应10-30min；其中NHS:EDC的质量浓度比为25:10；(2)偶联：离心后去除上清，再加入超纯水，超声复溶，重复离心复溶，加入p16INK4a单克隆抗体，旋涡混合，摇床100-500r/min，30-37℃反应1-3h；磁珠与抗体的标记比例为(50-150):1；(3)封闭，洗涤，保存。作为一个优选方案，所述磁珠粒径为100nm-5μm，表面修饰为羧基、羟基或链霉亲和素中的一种。免疫荧光微球粒径为100nm-500nm，表面修饰为羧基、羟基或链霉亲和素中的任意一种。作为一个优选方案，所述校准品为用缓冲液将p16抗原配制成0-100pg/mL系列浓度的校准溶液系列。作为一个优选方案，所述缓冲液包括缓冲体系、封闭试剂、阻断剂和防腐剂；所述缓冲体系包括PBS、Tris或CBS缓冲液中的任意一种，且浓度为10-50mmol/L，PH值为7.0-9.0；所述封闭试剂包括牛血清白蛋白或酪蛋白中的任意一种，且质量浓度为1-15％；所述阻断剂包括IgG蛋白，且质量浓度为0.1-1％；所述防腐剂包括叠氮钠或Proclin300中的任意一种，且质量浓度为0.01-0.1％。作为一个优选方案，所述稀释缓冲液配方包括：10-50mmol/LTris-HCl、0.1-5％酪蛋白、1--5％BSA、0.01-1％Proclin300、0.01％-1Tween20、0.9％NaCl，缓冲液调pH至7.2-7.4。作为一个优选方案，所述洗涤液配方包括：10-50mmol/L的Tris-HCl、0.01-1％的Tween20和0.9％的NaCl，缓冲液调pH至7.2-7.4。本专利技术通过将磁珠与p16INK4a抗体偶联且将吖啶酯标记葡聚糖多聚p16INK4a抗体，两者与样本中p16INK4a抗原在反应管中经过震荡孵育后形成免疫磁珠-p16INK4a抗原-吖啶酯葡聚糖多聚抗体复合物；用全自动化学发光仪测定其化学发光强度；对照标准品曲线以确定样品中p16INK4a抗原的量。本专利技术的优点在于，本专利技术提供的试剂盒采用化学发光检测技术，结合葡聚糖的信号放大吖啶酯的化学发光体系更有利于检测细胞样本中的p16INK4a抗原含量，具有非常高的灵敏度，与现有的p16INK4a化学发光检测相比抗体使用量更少，干扰更低，具有较大的临床推广价值。附图说明图1为实施例试剂盒的线性区间测量数据图。具体实施方式以下，结合具体实施方式对本专利技术的技术进行详细描述。应当知道的是，以下具体实施方式仅用于帮助本领域技术人员理解本专利技术，而非对本专利技术的限制。实施例1.步骤1：p16INK4a抗体磁珠制备步骤为：磁珠活化后与抗p16INK4a单克隆抗体偶联，封闭，洗涤，保存。吖啶酯标记葡聚糖多聚p16INK4a抗体制备步骤为：活化后的吖啶酯与活化后的葡聚糖和p16INK4a抗体三者偶联，封闭，洗涤，保存。免疫磁珠粒径为100nm-5μm，表面修饰为羧基、羟基或链霉亲和素中的任意一种；免疫荧光微球粒径为100nm-500nm，表面修饰为羧基、羟基或链霉亲和素中的任意一种。免疫磁珠的活化与偶联具体操作步本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于葡聚糖信号放大的p16

【技术特征摘要】
1.一种基于葡聚糖信号放大的p16INK4a化学发光试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括p16INK4a校准品，p16INK4a抗体磁珠，吖啶酯标记葡聚糖多聚p16INK4a抗体，缓冲液，稀释缓冲液以及洗涤液；
所述吖啶酯标记葡聚糖多聚p16INK4a抗体的制备方法为：
(1)葡聚糖活化：将葡聚糖溶于磷酸盐缓冲溶液中，加入适量高碘酸钠进行氧化，用葡聚糖基质相同磷酸盐缓冲溶液进行透析过夜；
(2)吖啶酯活化：加入NHS旋涡混合，再加入EDC旋涡混合；摇床100-500r/min，30-37℃反应10-30min；其中NHS:EDC的质量浓度比为25:10；
(3)偶联：离心后去除上清，加入超纯水，超声复溶，重复离心复溶，加入p16INK4a单克隆抗体和活化葡聚糖，旋涡混合，摇床100-500r/min，30-37℃反应1-3h；
(4)封闭，洗涤，保存。


2.根据权利要求1所述一种基于葡聚糖信号放大的p16INK4a化学发光试剂盒，其特征在于，所述p16INK4a抗体磁珠的制备方法为：
(1)免疫磁珠的活化：加入NHS旋涡混合，再加入EDC旋涡混合；摇床100-500r/min，30-37℃反应10-30min；其中NHS:EDC的质量浓度比为25:10；
(2)偶联：离心后去除上清，再加入超纯水，超声复溶，重复离心复溶，加入p16INK4a单克隆抗体，旋涡混合，摇床100-500r/min，30-37℃反应1-3h；磁珠与抗体的标记比例为(50-150):1；
(3)封闭，洗涤，保存。


3.根据权利要求2所述的一种基于葡聚糖信号放...

【专利技术属性】
技术研发人员：李文成，孙康俊，黄宝福，
申请(专利权)人：江苏美克医学技术有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32