一种雌雄异株植物生长早期性别鉴定的方法技术

本发明专利技术公开了一种雌雄异株植物生长早期性别鉴定的方法，可对自然生长的雌雄异株植物直接进行性别鉴定，避免了使用多个成年雄株和雌株实验杂交产生的后代进行性别鉴定，鉴定周期漫长，方法繁琐。筛选出的雌雄异株植株的性别特异性标记M1和M2，对自然环境下生长早期的雌雄异株植株种群进行性别鉴定，具有简单、准确和高效的特点。

A method for sex identification of dioecious plants at early growth stage

【技术实现步骤摘要】
一种雌雄异株植物生长早期性别鉴定的方法
本专利技术属于植物鉴别领域，具体涉及一种雌雄异株植物生长早期性别鉴定的方法。
技术介绍
全世界雌雄异株植株超过15000种。在绝大部分雌雄异株植物幼年期，无法通过形态性状对其性别进行准确鉴定，给这类型植物在林业和农业生产、应用带来很大的阻碍。目前，常规性对雌雄异株植物幼年期进行性别鉴定主要是利用扩增片段长度多态(AmplifiedFragmentLengthPolymorphism,AFLP)、随机扩增DNA多态性(RandomamplificationofpolymorphicDNA，RAPD)、简单重复序列间(Inter-simplesequencerepeat，ISSR)、序列扩增区域(sequencecharacterizedamplifiedregions，SCAR)、相关序列扩增多态性(Sequence-RelatedAmplifiedPolymorphism，SRAP)和简单重复序列(SimpleSequenceRepeat，SSR)等技术对植物进行性别特异性分子标记。但这些方法是基于PCR技术进行的，需要极大量的引物或引物对来筛选与性别相关的标记，因此费时又费力并且效率低下。RAD-seq是一种基于基因组限制性酶切和高通量测序的一种新技术，可以在很短的时间内完成几万甚至几十万个基因组位点的测序。由于许多雌雄异株植物为木本植物，世代周期长或者种子数量少，因此在许多木本植物中进行实验性杂交是不切实际的。即使对于一年生植物，构建作图群体需要花费大量的人力物力和时间，这限制了RAD-seq技术在雌雄异株植物性别鉴定中的应用。ddRAD-seq建立的文库存有大量的信息。但无人报道是否存在部分信息可用于雌雄异株植物性别的鉴定。根据上述问题，探索可用于鉴别雌雄异株植物性别的信息成为亟需解决的问题。
技术实现思路
本专利技术的目的在于利用基因组限制性酶切和高通量测序技术，使用改进的双酶切RAD-seq(ddRAD-seq)方法，简单、快速、准确和高效地对幼年期的雌雄异株植株进行性别鉴定。除非特定说明，以下试剂均为市售。本专利技术所采取的技术方案是：本专利技术第一个方面，提出性别特异性ddRAD基因座M1和M2。根据本专利技术的实施例，所述基因座M1和M2的核苷酸序列如下：M1：GGAAAATTTCCATGTGATTCAGATCTTGAGAAATATTTAGATCACATGGTTCATATTCCTGTTAGCGAACTCCAGTATTAGATCACATG；M2：CGTGGCAATACAATAACAAAAACAGAAAATAATAACAACAGCAATACAGTTTTTACAATAAATCGTTGGGAATTGCTCATATACTAGCCGAC。本专利技术第二个方面，提出一种扩增前面所述性别特异性ddRAD基因座M1和M2的引物组。根据本专利技术的实施例，所述引物组的核苷酸序列如下：M1M1-F：GCATTGATAGTGTGGATCATGC；M1-R：CCATGTGATTCAGATCTTGAGAA；M2M2-F：CGCATACGTACGCCACTTAG；M2-R：CGCAAGCAGCCTAAGGGATCAA。本专利技术第三个方面，提出一种检测雌雄异株植物生长早期性别鉴定的试剂盒，包括前面所述引物组。本专利技术第四个方面，提出一种载体，包括上述所述性别特异性ddRAD基因座M1和M2。本专利技术第五个方面，提出前面所述的性别特异性ddRAD基因座、引物组在制备雌雄异株植物生长早期性别鉴定试剂盒中的应用。本专利技术第六个方面，提出一种雌雄异株植物生长早期性别鉴定的方法。根据本专利技术的实施例，所述方法包括以下步骤：1)提取样本的基因组DNA；2)以提取的基因组DNA作为模板，使用前面所述的引物组M1-F、M1-R、M2-F和M2-R进行PCR扩增；3)对所述扩增片段进行分析，以鉴定样本的性别。根据本专利技术的实施例，所述雌雄异株植物为海漆属植物。根据本专利技术的实施例，所述海漆属植物为海漆。根据本专利技术的实施例，所述早期性别鉴定为雌雄异株植物开花前性别鉴定。根据本专利技术的实施例，步骤3)所述样本性别鉴定方法：若M1引物在样本中扩增出3个条带，则样本为雄性；若在样本中扩增2个条带，则样本为雌性。根据本专利技术的实施例，步骤3)所述样本性别鉴定方法：若M2引物在样本扩增出1个条带，则样本为雄性；若在样本中没有扩增出条带，则样本为雌性。本专利技术的有益效果：本专利技术可对自然生长的雌雄异株植物直接进行性别鉴定，避免了使用多个成年雄株和雌株实验杂交产生的后代进行性别鉴定，鉴定周期漫长，方法繁琐。筛选出的雌雄异株植株的性别特异性标记，对自然环境下生长早期的雌雄异株植株种群进行性别鉴定，具有简单、准确和高效的特点。具体实施方式下面通过具体实施例对本专利技术的技术方案做进一步的描述说明。实施例1本专利技术根据已构建好的ddRAD文库，选取ddRAD基因座(M1和M2)，M1的核苷酸序列：GGAAAATTTCCATGTGATTCAGATCTTGAGAAATATTTAGATCACATGGTTCATATTCCTGTTAGCGAACTCCAGTATTAGATCACATG(SEQIDNO.1)；M2的核苷酸序列：CGTGGCAATACAATAACAAAAACAGAAAATAATAACAACAGCAATACAGTTTTTACAATAAATCGTTGGGAATTGCTCATATACTAGCCGAC(SEQIDNO.2)。根据上述核酸序列设计了分别针对M1和M2的PCR引物；本专利技术经过大量筛选，分别筛选出灵敏度高和特异性强的引物，序列如下：M1：M1-F：GCATTGATAGTGTGGATCATGC(SEQIDNO.3)；M1-R：CCATGTGATTCAGATCTTGAGAA(SEQIDNO.4)；M2：M2-F：CGCATACGTACGCCACTTAG(SEQIDNO.5)；M2-R：CGCAAGCAGCCTAAGGGATCAA(SEQIDNO.6)。实施例3一种载体，包括实施例1所述ddRAD基因座M1和M2的核苷酸序列。对比例1雌雄异株植物红背桂(Excoecariacochinchinensis)生长早期性别鉴定的方法：用本专利技术的M1和M2基因座的引物，分别在雌雄异体的红背桂进行跨物种扩增。结果：M1在红背桂扩增出条带，但未扩增出雄性特异性条带，雌、雄之间扩增结果差异不明显。M2在红背桂中没有扩增出雄性特异性条带。说明本专利技术的M1、M2具有较高的特异性。对比例2雌雄异株植物云南土沉香(Excoecariaacerifolia)生长早期性别鉴定的方法：用本专利技术的M1本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.性别特异性ddRAD基因座M1和M2，其特征在于，所述基因座M1和M2的核苷酸序列如下：/nM1：/nGGAAAATTTCCATGTGATTCAGATCTTGAGAAATATTTAGATCACATGGTTCATATTCCTGTTAGCGAACTCCAGTATTAGATCACATG；/nM2：/nCGTGGCAATACAATAACAAAAACAGAAAATAATAACAACAGCAATACAGTTTTTACAATAAATCGTTGGGAATTGCTCATATACTAGCCGAC。/n

【技术特征摘要】
1.性别特异性ddRAD基因座M1和M2，其特征在于，所述基因座M1和M2的核苷酸序列如下：
M1：
GGAAAATTTCCATGTGATTCAGATCTTGAGAAATATTTAGATCACATGGTTCATATTCCTGTTAGCGAACTCCAGTATTAGATCACATG；
M2：
CGTGGCAATACAATAACAAAAACAGAAAATAATAACAACAGCAATACAGTTTTTACAATAAATCGTTGGGAATTGCTCATATACTAGCCGAC。


2.一种扩增权利要求1所述性别特异性ddRAD基因座M1和M2的引物组，其特征在于，所述引物组的核苷酸序列为：
M1
M1-F：GCATTGATAGTGTGGATCATGC；
M1-R：CCATGTGATTCAGATCTTGAGAA；
M2
M2-F：CGCATACGTACGCCACTTAG；
M2-R：CGCAAGCAGCCTAAGGGATCAA。


3.一种检测雌雄异株植物生长早期性别鉴定的试剂盒，其特征在于，包括权利要求2所述引物组。


4.一种载体...

【专利技术属性】
技术研发人员：谭广文，周仁超，曾凤，周玉兵，关开朗，路秉翰，谢腾芳，李银，易慧琳，张信坚，
申请(专利权)人：广州普邦园林股份有限公司，中山大学，广州捷锐生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44