一种用于啤酒中呕吐毒素的模型建立方法及其应用技术

本发明专利技术公开一种用于啤酒中呕吐毒素的模型建立方法及其应用，包括以下步骤：S1、样品模版DNA制备；S2、引物合成；S3、qPCR反应体系；S4、qPCR定量；S5、预测微生物学模型的建立。本发明专利技术将qPCR技术检测镰刀菌生物量、HPLC检测DON含量与食品预测微生中物学相结合，构建啤酒酿造过程DON的生成模型，是研究啤酒中DON污染机制潜力策略。而且，根据模型方程，设定镰刀菌生物量和DON含量的阈值，计算安全的啤酒原料污染水平以及酿造工艺参数值，可初步用于预警。

A method for modeling vomitus in beer and its application

【技术实现步骤摘要】
一种用于啤酒中呕吐毒素的模型建立方法及其应用
本专利技术涉及检测方法
，具体是一种用于啤酒中呕吐毒素的模型建立方法及其应用。
技术介绍
呕吐毒素，学名为脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol,简称DON)，由易于侵染田间生长的大麦、小麦、玉米等谷物的多种镰刀菌(Fusariumspp.)产生。DON具有耐热和水溶两大特性，在食品加工过程中不易被破坏，被联合国粮农组织和世界卫生组织(FAO/WHO)确定为最危险的自然发生食品污染物之一，并提出每人每日最大摄入量1μg/Kg体重。我国《GB2761-2011食品中真菌毒素限量》规定，食品加工用小麦、大麦、玉米中DON的限量标准为1mg/kg。研究表明，DON从大麦原料经酿造过程进入成品啤酒的途径有两种：一，啤酒大麦在田间生长阶段原始积累的DON，在啤酒生产过程中不能被破坏或通过麦糟除去的部分经过发酵液带到成品啤酒中；二，存留在啤酒原料籽粒内部的产毒镰刀菌，在啤酒生产过程中，主要是麦芽制造阶段，再次产生的DON也会一起进入成品啤酒中。而后者是主要途径，因为啤酒大麦发芽之前的浸泡过程中，籽粒中原始积累的DON大部分(约90％)会流失到浸麦水中，而接下来的发芽阶段，在15-18℃的温度和90％以上湿度的适宜环境下，大麦籽粒中的镰刀菌再次大量合成DON，是成品啤酒中DON的主要来源。从江苏省采收的赤霉病啤酒大麦研究发现，在大麦发芽阶段产生的DON，其总量约占原料大麦中的50％，而麦芽中约90％的DON最终可以进入成品啤酒中。因此，啤酒中DON主要来源于麦芽制造阶段镰刀菌的产毒。啤酒是以发芽的啤酒大麦为主要原料，添加其它谷物(小麦、大米、玉米淀粉等)，经麦芽制造、麦汁提取、加酒花煮沸、酵母发酵酿造而成的一种含有二氧化碳、低酒精度的饮料。而我国啤酒生产的一个重要特点是以小麦作为原料的比例较高。传统上，啤酒酿造的主要原料是啤酒大麦，而我国所种植啤酒大麦的产量远远不能满足我国啤酒高产量的需求，近70％的啤酒大麦依赖于进口，大幅提升了国产啤酒的原料成本。而我国是小麦生产大国，小麦价格远远低于啤酒大麦价格。同时，在国内啤酒行业恶性价格战引起的啤酒利润空间较低的形势下，小麦作为啤酒酿造替代原料的比例不断升高，国产啤酒酿造原料中小麦的比例通常高达50-60％，甚至100％采用小麦原料。目前，小麦啤酒市场前景广阔。小麦作为啤酒生产原料，其加工过程包括浸麦、发芽和焙燥三个阶段。在浸麦，即按照一定工艺条件的麦子浸泡过程中，麦子籽粒表面的微生物被清洗，麦子并吸收水分为发芽做准备。麦子发芽主要目的在于生成大量的酶使得淀粉、蛋白质等大分子物质降解为后续啤酒发酵过程中易于酵母代谢的小分子物质，发芽的一般条件为温度在16-18℃之间，环境湿度达到90％以上，发芽4天左右。焙燥阶段将麦子烘干，使发芽进程结束。在发芽过程中，麦子籽粒内部没有被清洗掉微生物，尤其是小麦在田间生长的灌浆期易于污染的镰刀菌不能不充分清洗掉，会在这种适宜的条件下再次大幅生长，并大量产生DON。近些年，世界上发达国家对啤酒中DON检出事件的报道逐渐减少，主要原因在于，目前采取了控制啤酒酿造原料中DON含量的策略。加拿大对啤酒大麦中DON的限量为“未检出”，美国对FDA一般食品加工用的小麦、大麦等谷物中DON的限量为1mg/kg。然而，美国啤酒行业规定对DON含量的限量标准为0.5mg/kg，拒绝收购DON含量超过0.5mg/kg的啤酒大麦，对于DON含量在零与0.5mg/kg之间的啤酒大麦采取打折收购的政策，确保啤酒中DON基本为“零检出”。然而，与之形成鲜明对比的是，我国作为世界啤酒生产第一大国，目前中既没有对啤酒中DON发生情况的任何报道，也未出台对啤酒酿造中原料中DON含量相关的国家或行业标准。这是国产啤酒的一个食品安全隐患，同时也是阻碍国产啤酒出口的较大障碍，因此，本专利技术将qPCR技术检测镰刀菌生物量、HPLC检测DON含量与食品预测微生中物学相结合，构建啤酒酿造过程DON的生成模型，是研究啤酒中DON污染机制潜力策略。而且，根据模型方程，设定镰刀菌生物量和DON含量的阈值，计算安全的啤酒原料污染水平以及酿造工艺参数值，可初步用于预警。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对现有技术的缺陷和不足，提供一种用于啤酒中呕吐毒素的模型建立方法及其应用。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案是：一种用于啤酒中呕吐毒素的模型建立方法，其创新点在于，包括以下步骤：S1、样品模版DNA制备：采用微生物DNA提取试剂盒，从小麦或麦芽样品中提取微生物总DNA，其中包含镰刀菌的产毒DNA；S2、引物合成：从NCBI数据库检索到镰刀菌cDNA序列中控制DON合成的特异序列tri5，设计并合成PCR的引物；S3、qPCR反应体系：将每个样品的模版DNA、引物和Taqman荧光探针加入Powermix反应体系溶液，进行PCR扩增，并对PCR反应程序进行优化，得到产毒镰刀菌DNA的单一扩增峰、峰型对称、标准DNA定量线性关系良好的qPCR程序；S4、qPCR定量：PCR反应每经过一个循环，增加一个荧光信号，当荧光信号达到荧光阈值时所经历的循环次数CT值与起始模板的量呈线性关系，由于禾谷镰刀菌是最常见的DON产生菌，所以将从小麦样品中分离纯化得到的禾谷镰刀菌DNA作为标准品进行不同浓度的qPCR反应，制定与CT值之间的标准曲线，最后通过每个未知样品qPCR的CT值对其产DON镰刀菌DNA的浓度进行定量检测；S5、预测微生物学模型的建立：采用L18-Hunter结合Plackett-Burman设计，以发芽时间、温度、湿度、小麦原料中起始DON含量和产毒镰刀菌生物量为参数，以DON含量和产毒镰刀菌生物量为响应值，建立麦芽制造过程中镰刀菌产生DON的模型；以啤酒酿造过程中工艺条件和小麦起始DON含量为参数，以DON含量为响应值，建立啤酒酿造过程中DON含量的变化模型。一种应用啤酒中呕吐毒素模型的呕吐毒素检测方法，其创新点在于，包括以下步骤：S1、调研国内市场上小麦啤酒和小麦原料中DON的污染情况，为研究奠定事实基础，在此基础上筛选含有DON的小麦原料，并分析含有DON的小麦样品中产毒镰刀菌的生物量，为下一步研究啤酒酿造过程中DON的污染机制筛选原料样品；S2、研究小麦啤酒酿造过程中DON污染机制的核心在于建立DON的产生模型，而模型的准确性基于合理的取样方案：麦芽制造阶段的浸麦结束、发芽第一天、第二天、第三天和发芽结束环节取样，监测DON含量和产毒镰刀菌生物量；对麦汁制备阶段的煮沸前后分别取样，监测煮沸前麦汁中产毒镰刀菌生物量和DON含量，煮沸后麦汁中DON含量；发酵过程中前酵7天和后酵7天每天取样，监测DON含量，并对所建立的麦芽制造阶段镰刀菌生成DON模型和啤酒酿造过程中DON含量变化模型的准确性进行实验的验证；S3、初步运行建立的模型，将小麦啤酒中DON含量为零作为假设值，计算小麦原料中DON含量和产毒镰刀菌的生物量，即为造成啤酒中出现DON的小麦原料中起始DON含本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于啤酒中呕吐毒素的模型建立方法，其特征在于，包括以下步骤：/nS1、样品模版DNA制备：采用微生物DNA提取试剂盒，从小麦或麦芽样品中提取微生物总DNA，其中包含镰刀菌的产毒DNA；/nS2、引物合成：从NCBI数据库检索到镰刀菌cDNA序列中控制DON合成的特异序列tri5，设计并合成PCR的引物；/nS3、qPCR反应体系：将每个样品的模版DNA、引物和Taqman荧光探针加入Powermix反应体系溶液，进行PCR扩增，并对PCR反应程序进行优化，得到产毒镰刀菌DNA的单一扩增峰、峰型对称、标准DNA定量线性关系良好的qPCR程序；/nS4、qPCR定量：PCR反应每经过一个循环，增加一个荧光信号，当荧光信号达到荧光阈值时所经历的循环次数CT值与起始模板的量呈线性关系，由于禾谷镰刀菌是最常见的DON产生菌，所以将从小麦样品中分离纯化得到的禾谷镰刀菌DNA作为标准品进行不同浓度的qPCR反应，制定与CT值之间的标准曲线，最后通过每个未知样品qPCR的CT值对其产DON镰刀菌DNA的浓度进行定量检测；/nS5、预测微生物学模型的建立：采用L18-Hunter结合Plackett-Burman设计，以发芽时间、温度、湿度、小麦原料中起始DON含量和产毒镰刀菌生物量为参数，以DON含量和产毒镰刀菌生物量为响应值，建立麦芽制造过程中镰刀菌产生DON的模型；以啤酒酿造过程中工艺条件和小麦起始DON含量为参数，以DON含量为响应值，建立啤酒酿造过程中DON含量的变化模型。/n...

【技术特征摘要】
1.一种用于啤酒中呕吐毒素的模型建立方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、样品模版DNA制备：采用微生物DNA提取试剂盒，从小麦或麦芽样品中提取微生物总DNA，其中包含镰刀菌的产毒DNA；
S2、引物合成：从NCBI数据库检索到镰刀菌cDNA序列中控制DON合成的特异序列tri5，设计并合成PCR的引物；
S3、qPCR反应体系：将每个样品的模版DNA、引物和Taqman荧光探针加入Powermix反应体系溶液，进行PCR扩增，并对PCR反应程序进行优化，得到产毒镰刀菌DNA的单一扩增峰、峰型对称、标准DNA定量线性关系良好的qPCR程序；
S4、qPCR定量：PCR反应每经过一个循环，增加一个荧光信号，当荧光信号达到荧光阈值时所经历的循环次数CT值与起始模板的量呈线性关系，由于禾谷镰刀菌是最常见的DON产生菌，所以将从小麦样品中分离纯化得到的禾谷镰刀菌DNA作为标准品进行不同浓度的qPCR反应，制定与CT值之间的标准曲线，最后通过每个未知样品qPCR的CT值对其产DON镰刀菌DNA的浓度进行定量检测；
S5、预测微生物学模型的建立：采用L18-Hunter结合Plackett-Burman设计，以发芽时间、温度、湿度、小麦原料中起始DON含量和产毒镰刀菌生物量为参数，以DON含量和产毒镰刀菌生物量为响应值...

【专利技术属性】
技术研发人员：李锋，
申请(专利权)人：南通科技职业学院，
类型：发明
国别省市：江苏;32