基于CRISPR/Cas9 SunTag系统抑制双生病毒侵染的载体及其构建和应用技术方案

本发明专利技术公开了一种基于CRISPR/Cas9 SunTag系统抑制双生病毒侵染的载体及其构建和应用，该方法利用搭载甲基转移酶DRM2的CRISPR/dCas9 Sun Tag系统，构建针对TYLCCNV和TYLCCNB特定区域的sgRNA，从而使得TYLCCNV和TYLCCNB特定区域被DRM2识别并被甲基化。为了增强识别和甲基化的效果，分别设计了三个sgRNA(g16/g17/g9A)靶标TYLCCNV和三个sgRNA(g1/g14/g9B)靶标TYLCCNB的甲基化敏感区域，并将三个sgRNA依次插入pEG302载体，从而得到可以定点靶标并进行甲基化修饰TYLCCNV的pEG302‑A和定点靶标并进行甲基化修饰TYLCCNB的pEG302‑β的抑制双生病毒侵染的载体。

Construction and application of a vector based on CRISPR / cas9 suntag system to inhibit the infection of geminivirus

【技术实现步骤摘要】
基于CRISPR/Cas9SunTag系统抑制双生病毒侵染的载体及其构建和应用
本专利技术涉及基因工程领域，特别是涉及一种基于CRISPR/Cas9SunTag系统表达DRM2基因靶标TYLCCNV从而抑制双生病毒侵染载体及其构建方法和应用。
技术介绍
中国番茄黄化曲叶病毒(TomatoyellowleafcurlChinavirus,TYLCCNV)是我国广泛存在的一种双生病毒，在田间伴随有卫星分子中国番茄黄化曲叶病毒β(TomatoyellowleafcurlChinabetasatellite,TYLCCNB)一起侵染茄科作物。TYLCCNV/TYLCCNB通过烟粉虱传播，感病番茄植株矮化，生长缓慢或停滞，顶部叶片常稍褪绿发黄、变小，叶片边缘上卷，叶片增厚，叶质变硬，叶背面叶脉常显紫色。目前该病害已经在我国大规模爆发，在多种作物上造成了严重的危害。以番茄为例，2009年我国番茄黄化曲叶病毒病的年发生面积超过300万亩，遭受严重损失的面积在100万亩以上，经济损失超过50亿人民币，近几年发病面积进一步扩大，对番茄生产造成了严重损失。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于CRISPR/Cas9 Sun Tag系统抑制双生病毒侵染的载体，其特征在于：所述双生病毒为中国番茄黄化曲叶病毒(TYLCCNV)及伴随的卫星(TYLCCNB)；/n在pEG302 22aa Sun Tag NtDRMcd(简称pEG302)载体上插入针对中国番茄黄化曲叶病毒TYLCCNV的三个sgRNA，即三靶点的sgRNA(g16/g17/g9A)，得到载体pEG302 22aa Sun TagNtDRMcd-A(简称pEG302-A)；/n在pEG302 22aa Sun Tag NtDRMcd(简称pEG302)载体上插入针对中国番茄黄化曲叶病毒β(TYLCCNB)的三个s...

【技术特征摘要】
1.一种基于CRISPR/Cas9SunTag系统抑制双生病毒侵染的载体，其特征在于：所述双生病毒为中国番茄黄化曲叶病毒(TYLCCNV)及伴随的卫星(TYLCCNB)；
在pEG30222aaSunTagNtDRMcd(简称pEG302)载体上插入针对中国番茄黄化曲叶病毒TYLCCNV的三个sgRNA，即三靶点的sgRNA(g16/g17/g9A)，得到载体pEG30222aaSunTagNtDRMcd-A(简称pEG302-A)；
在pEG30222aaSunTagNtDRMcd(简称pEG302)载体上插入针对中国番茄黄化曲叶病毒β(TYLCCNB)的三个sgRNA，即三靶点的sgRNA(g1/g14/g9B)，得到pEG30222aaSunTagNtDRMcd-β(简称pEG302-β)。


2.根据权利要求1所述的基于CRISPR/Cas9SunTag系统抑制双生病毒侵染的载体的构建方法，其特征在于：所述载体pEG302-A的构建方法，包括以下步骤：
(1)在TYLCCNV序列中选定PAM位点并设计gRNA；包括pEG302-A载体所需的三个靶点所需的六条gRNA链：g16-A/B，g17-A/B，g9A-A/B；其序列如SEQID：No.1-6所示；
(2)将(1)中所述单链gRNA合成为双链；
(3)包含g16单靶点的AtU6-26-sgRNA-SK-g16载体的构建；
(4)包含g17单靶点的AtU6-26-sgRNA-SK-g17载体的构建；
(5)含有g16，g17的双靶点AtU6-26-sgRNA-SK-g16+g17载体的构建；
(6)AtU6-1-sgRNA-SK载体的构建；
(7)含有g9A单靶点的AtU6-1-sgRNA-SK-g9A载体的构建；
(8)三靶点的SK-g16+g17+g9A载体的构建；
(9)pEG302-A终载体的构建。


3.根据权利要求2所述的基于CRISPR/Cas9SunTag系统抑制双生病毒侵染的载体的构建方法，其特征在于：所述载体pEG302-A的构建方法中，
步骤(3)具体为：
①1ugAtU6-26-sgRNA-SK质粒，BsaI-HF1uL，10×cutsmartbuffer5uL；剩余体系用ddH2O补足；37℃酶切60min，然后纯化DNA，-20℃冷冻保存；
②10×T4DNAligasebuffer2uL，酶切后的AtU6-26-sgRNA-SK载体80ng，双链化gRNA1uL，T4DNAligase1uL，ddH2O定容至20uL；PCR仪控温22℃反应15min；
③将10uL连接产物转化到大肠杆菌DH5α中，使用氨苄青霉素作为抗性筛选，挑选单克隆做菌落PCR鉴定并测序，确认靶点是否连入载体；
鉴定引物：
F：M13F：GTTGTAAAACGACGGCCAG；其序列如SEQID:No.13所示；
R：g16-B：AAACCCACTGTCCGCGTCACCAGA；其序列如SEQID：No.2所示；
将正确的克隆进行扩大培养，提取质粒，并用M13F/R引物测序，至此得到含有g16单靶点的AtU6-26-sgRNA-SK-g16(简称SK-U6-26-g16)载体；
步骤(4)具体为：
①1ugAtU6-26-sgRNA-SK质粒，BsaI-HF1uL，10×cutsmartbuffer5uL；剩余体系用ddH2O补足；37℃酶切60min，然后纯化DNA，-20℃冷冻保存；
②10×T4DNAligasebuffer2uL，酶切后的AtU6-26-sgRNA-SK载体80ng，双链化gRNA1uL，T4DNAligase1uL，ddH2O定容至20uL；PCR仪控温22℃反应15min；
③将10uL连接产物转化到大肠杆菌DH5α中，使用氨苄青霉素作为抗性筛选，挑选单克隆做菌落PCR鉴定并测序，确认靶点是否连入载体；
鉴定引物:
F：M13F：GTTGTAAAACGACGGCCAG；其序列如SEQID:No.13所示；
R：g17-B：AAACCCATGAATTCTTTAAAGTGC；其序列如SEQID：No.4所示；
将正确的克隆进行扩大培养，提取质粒，并用M13F/R引物测序，至此得到含有g17单靶点的AtU6-26-sgRNA-SK-g17(简称SK-U6-26-g17)载体。
步骤(5)具体为：
①单酶切SK-U6-26-g16；质粒1ug，SpeI1uL，10×buffer2uL，FastAP1uL，ddH2O补足至20uL体系；37℃30min；DNA纯化回收；
②双酶切SK-U6-26-g17；质粒1ug，SpeI1uL，NheI1uL，10×buffer2uL，ddH2O补足至20uL体系；37℃30min；割胶回收小片段，约500bp；
③10×T4DNAligasebuffer2uL，单酶切后的SK-U6-26-g16线性化载体50ng，双酶切后的SK-U6-26-g17DNA小片段10ng，T4DNAligase1uL，ddH2O定容至20uL；PCR仪控温22℃反应15min；
④将10uL连接产物转化到大肠杆菌DH5α中，使用氨苄青霉素作为抗性筛选，挑选单克隆做菌落PCR鉴定并测序，确认双靶点是否连入载体；
鉴定引物:
F：g16-A：ATTGTCTGGTGACGCGGACAGTGG；其序列如SEQID:No.1所示；
R：g17-B：AAACCCATGAATTCTTTAAAGTGC；其序列如SEQID:No.4所示；
将正确的克隆进行扩大培养，提取质粒，并用M13F/R引物测序，至此得到双靶点的SK-U6-26-g16+g17载体；
步骤(6)具体为：
①AtU6-1启动子的克隆：
所需引物：其序列如SEQID:No.15-16所示；
if-SK-U6-1-F：AGGGCGAATTGGGTGCTAGCGAAATCTCAAAATTCCGG
if-SK-U6-1-R：CTAAAACTGAGACCTGAATTCAGGTCTCTCAATCACTACTTCGT
5×FastPfubuffer10uL，dNTP4uL，引物F/R1uL，拟南芥cDNA1uL，FastPfu酶1uL，ddH2O补足至50uL体系；PCR仪控温，95℃1min，(95℃20sec，55℃20sec，72℃90sec，35×cycle)，72℃5min，4℃5min；纯化回收DNA；
②双酶切AtU6-26-sgRNA-SK载体，质粒1ug，EcoRI1uL，NheI1uL，10×buffer2uL，ddH2O补足至20uL体系；37℃30min；割胶回收大片段；
③Infusion法换启动子：第二步线性化载体60ng，AtU6-1基因90ng，5×CEIIbuffer4uL，Exnase2uL，ddH2O补足至20uL体系；37℃30min；
④将10uL连接产物转化到大肠杆菌DH5α中，使用氨苄青霉素作为抗性筛选，挑选单克隆做菌落PCR鉴定并测序，确认启动子是否更换成功；
鉴定引物：其序列如SEQID:No.15-16所示；
F：if-SK-U6-1-F：AGGGCGAATTGGGTGCTAGCGAAATCTCAAAATTCCGG
R：if-SK-U6-1-R：CTAAAACTGAGACCTGAATTCAGGTCTCTCAATCACTACTTCGT
将正确的克隆进行扩大培养，提取质粒，并用上述引物测序，至此得到更换启动子后的AtU6-1-sgRNA-SK载体；
步骤(7)具体为：
①1ugAtU6-1-sgRNA-SK质粒，BsaI-HF1uL，10×cutsmartbuffer5uL；剩余体系用ddH2O补足；37℃酶切60min，然后纯化DNA，-20℃冷冻保存；
②10×T4DNAligasebuffer2uL，酶切后的AtU6-1-sgRNA-SK载体80ng，双链化gRNA1uL，T4DNAligase1uL，ddH2O定容至20uL；PCR仪控温22℃反应15min；
③将10uL连接产物转化到大肠杆菌DH5α中，使用氨苄青霉素作为抗性筛选，挑选单克隆做菌落PCR鉴定并测序，确认靶点是否连入载体；
鉴定引物：
F：M13F：GTTGTAAAACGACGGCCAG；其序列如SEQID:No.13所示；
R：g9A-B：AAACGTAATATTATACGGATGGCC；其序列如SEQID:No.6所示；
将正确的克隆进行扩大培养，提取质粒，并用M13F/R引物测序，至此得到单靶点的AtU6-1-sgRNA-SK-g9A(简称SK-U6-1-g9A)载体；M13F/R其序列如SEQID:No.13-14所示；
步骤(8)具体为：
①单酶切SK-U6-26-g16+17；质粒1ug，SpeI1uL，10×buffer2uL，FastAP1uL，ddH2O补足至20uL体系；37℃30min；DNA纯化回收；
②双酶切SK-U6-1-g9A；质粒1ug，SpeI1uL，NheI1uL，10×buffer2uL，ddH2O补足至20uL体系；37℃30min；割胶回收小片段；
③10×T4DNAligasebuffer2uL，单酶切后的SK-U6-26-g16+g17线性化载体50ng，双酶切后的SK-U6-1-g9A的DNA10ng，T4DNAligase1uL，ddH2O定容至20uL；PCR仪控温22℃反应15min；
④将10uL连接产物转化到大肠杆菌DH5α中，使用氨苄青霉素作为抗性筛选，挑选单克隆做菌落PCR鉴定并测序，确认双靶点是否连入载体；
鉴定引物：
F：g16-A：ATTGTCTGGTGACGCGGACAGTGG；其序列如SEQID:No.1所示；
R：g9A-B：AAACGTAATATTATACGGATGGCC；其序列如SEQID:No.6所示；
将正确的克隆进行扩大培养，提取质粒，并用M13F/R引物测序，至此得到三靶点的SK-g16+g17-g9A载体；M13F/R其序列如SEQID:No.13-14所示；
步骤(9)具体为：
①单酶切pEG302载体；质粒1ug，KpnI1uL，10×buffer2uL，FastAP1uL，ddH2O补足至20uL体系；37℃30min；DNA纯化回收；
②以SK-g16+g17-g9A载体为模板，扩增包含三靶点的片段：5×FastPfubuffer10uL，dNTP4uL，引物F/R1uL，质粒1uL，FastPfu酶1uL，ddH2O补足至50uL体系；PCR仪控温，95℃1min，(95℃20sec，55℃20sec，72℃90sec，35×cycle)，72℃5min，4℃5min；割胶回收DNA；
所需引物：其序列如SEQID:No.17-18所示；
pEG30...

【专利技术属性】
技术研发人员：李方方，李浩，龚攀，周雪平，
申请(专利权)人：中国农业科学院植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11