一种培育抗逆杨树的基因工程方法技术

本发明专利技术属于植物育种领域，尤其是植物生物技术育种领域，具体涉及一种培育抗逆杨树的方法。本发明专利技术将不同调控途径的两种转录因子基因ckAREB和JERF36#构建到同一载体pBIJEAR上，实现了两个转录因子基因相对稳定的结合，以杨树优良品种凌丰2号杨作为受体材料，通过农杆菌介导进行多基因共转化研究，建立了高效稳定的遗传转化体系，获得转基因植株。通过分子、生理等实验研究，验证转基因杨树抗逆能力，从而获得了抗逆性显著提高的转基因杨树，为我国干旱、半干旱、盐碱地区培育更多和更优良的杨树新品种了奠定基础。

A genetic engineering method for cultivating stress resistant poplar

【技术实现步骤摘要】
一种培育抗逆杨树的基因工程方法
本专利技术属于植物育种领域，尤其是植物生物技术育种领域，具体涉及一种培育抗逆杨树的基因工程方法。
技术介绍
我国干旱、半干旱地区约占国土总面积的1/2，再加上林木基因资源和木本植物自身生物学特性的限制，能够用于困难地造林的林木品种十分缺乏，严重限制了当地的生态建设及经济建设的发展。因此，培育林木抗逆新品种已成为林木良种选育的重要趋势。杨树(PopulusL.)生长快、适应性强、木材用途广，在水土保持和维护生态环境方面发挥着重要作用，是我国绿化、造林和工业用材的重要树种，但现有大多数杨树品种抗旱性较差，难以在干旱地区发挥其高产潜力。相对于常规育种途径，基因工程育种不仅可以缩短育种周期，又可在基因水平上改造林木抗性遗传物质，提高了育种的目的性和可操作性，是加速林木改良的一个重要途径。长期以来，有关林木抗逆基因工程研究主要集中在具有重要性状功能基因的转化研究上。随着基因组学和功能基因组学的不断深入研究，人们发现，植物中许多抗逆性状是受多基因共同控制的，单个功能基因很难起到预期效果。因此，通过多个基因串联或共转化来改良林木抗性，培育优良新品种的分子育种手段已经受到高度重视。目前，已经成功培育出抗逆效果显著的多抗杨，经室内生理测定及田间试验证明，多抗杨的抗旱、耐盐、耐涝，抗虫等方面显著高于非转基因杨树，且其生长量较非转基因株系有明显优势。随着对基因功能及植物响应逆境胁迫机制的深入研究，人们发现，一些具有重要功能的转录因子调节基因通常参与多种逆境信号转导通路，可以同时调控多种抗性相关基因表达，在增强植物抗逆性方面的效果显著。但是这些转录因子调节基因在植物抗逆性研究和生产实践中的应用仍然十分有限。
技术实现思路
为了解决植物抗逆育性研究和生产实践中应用有限的问题，本专利技术提供了一种培育抗逆杨树的基因工程方法，利用该方法能够获得抗逆性显著提高的转基因杨树。为此，本专利技术提供了一种培育抗逆杨树的方法，其包括以下步骤：1、材料的选择；2、抗逆转录因子双基因载体pBIJEAR的构建；3、农杆菌介导的杨树叶片的遗传转化；4、转基因植株的分子检测；和5温室移栽及抗逆性测定。在本专利技术进一步优选的实施方案中，步骤1中所述的材料为未木质化和半木质化当年生枝条。在本专利技术进一步优选的实施方案中，步骤2中所述的构建为将来源于番茄的乙烯应答响应元件(JERF36#)和柠条的ABA响应元件结合蛋白基因(ckAREB)构建到同一植物表达载体上，从而构建JERF36-ckAREB双基因植物表达载体(pBIJEAR)，实现抗逆调控基因相对稳定串联。本专利技术人发现，生长在干旱、盐碱荒地等恶劣生态环境中的柠条(CaraganaKorshinskii)等木本植物，均具有极强的对盐碱、干旱等极端生态环境的适应能力。如柠条可在沙层含水率2-3％的流动沙地和沙丘间低地正常生长，也能抵御-30℃-40℃的严寒。霸王是一种强旱生型植物，天然分布于荒漠、草原化荒漠及荒漠化草原地带，分布区年降水量一般在50～200mm左右。利用从极端抗逆木本植物中克隆出的抗逆基因对林木进行转化切实可行。ABA响应元件结合蛋白基因ckAREB是从柠条中克隆分离出的，其编码含bZIP/AREB结构域的AREB转录因子。同时，本专利技术人发现，来自番茄的乙烯应答响应元件(JERF36#)，该基因编码EREBP类转录因子，专一结合GCC-box，也与抗逆有关。本专利技术将上述不同调控途径的两种转录因子基因构建到同一载体上，从而实现了多个转录因子基因相对稳定的结合。在本专利技术进一步优选的实施方案中，步骤3中所述的遗传转化进一步包括：1、叶片侵染；2、共培养；和3、选择培养。在本专利技术更加优选的实施方案中，所述的叶片侵染为取生长健壮的无菌苗叶片垂直于叶脉切3-4个切口，放入叶片再生培养基中，预培养1-3天，取出预培养叶盘浸入转化菌液中，侵染10-15min，期间轻微震荡，确保叶片与菌液充分接触。在本专利技术更加优选的实施方案中，所述的共培养为取出叶盘，在无菌滤纸上吸干，接种到最佳叶片再生培养基上，27℃，黑暗条件下共培养2～3d。在本专利技术更加优选的实施方案中，所述的选择培养为将农杆菌侵染后的叶片在附加Cef300mg·L-1的分化筛选培养基中培养，当抗性芽长至1.0～1.5cm时，再转入附加Cef400mg·L-1的生根筛选培养基中培养。在本专利技术更加优选的实施方案中，所述的分化筛选培养基为MS+6-BA0.5mg·L-1+NAA0.05mg·L-1+Km30mg·L-1/Hyg5mg·L-1，生根筛选培养及为MS+IBA0.01mg·L-1+NAA0.01mg·L-1+Km20mg·L-1/hyg2mg·L-1。在本专利技术进一步优选的实施方案中，步骤4中所述的转基因植株的分子检测为通过PCR、qRT-PCR进行检测，确定转基因植株。在本专利技术进一步优选的实施方案中，步骤5中所述的温室移栽及抗逆性测定为组培扩繁转基因株系，当苗高为3.0cm时，移栽至温室，选取生长健康、长势一致的转基因株系与非转基因株系，放置光照培养箱中培养，待各株系长至10cm左右，分别向各株系营养钵中浇20％PEG-6000和150mMNaCl，处理7天后，进行叶绿素含量及脯氨酸等生理指标的测定。由上述分析可知，本专利技术将不同调控途径的两种转录因子基因构建到同一载体上，实现两个转录因子基因相对稳定的结合，以杨树优良品种凌丰2号杨(Populus×euramericanacl.‘Lingfeng2’)为受体材料，通过农杆菌介导进行多基因共转化研究，建立高效稳定的遗传转化体系，获得转基因植株。通过分子、生理等实验研究，验证转基因杨树抗逆能力，从而获得了抗逆性显著提高的转基因杨树，为我国干旱、半干旱、盐碱地区培育更多和更优良新品种奠定基础。附图说明图1：转基因杨树总叶绿素含量与对照对比示意图。图2：PEG胁迫盐胁迫下，转基因杨树游离脯氨酸和MDA含量与对照对比示意图。图3：盐胁迫下，转基因杨树总叶绿素含量与对照对比示意图。图4：盐胁迫下，转基因杨树游离脯氨酸和MDA含量与对照对比示意图。具体实施方式下面通过实施例对本专利技术作进一步的详细说明，旨在用于说明本专利技术而非限定本专利技术。应当指出，对于本领域技术人员而言，在不脱离本专利技术原理的前提下，还可以对本专利技术进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也同样落入本专利技术的保护范围之内。实施例1：抗逆凌丰2号杨的培育1、材料的选择采用未木质化和半木质化凌丰2号杨当年生枝条作为材料。2、抗逆转录因子双基因载体的构建将来源于柠条的ABA响应元件结合蛋白基因(ckAREB)及来源于草本植物番茄的茉莉酸乙烯应答元件基因(JERF36)构建到同一植物表达载体上，成功构建JERF36-ckAREB双基因植物表达载体(pBIJEAR)，实现抗本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种培育抗逆杨树的方法，其包括以下步骤：/n(1)材料的选择；/n(2)抗逆转录因子双基因载体pBIJEAR的构建；/n(3)农杆菌介导的杨树叶片的遗传转化；/n(4)转基因植株的分子检测；和/n(5)温室移栽及抗逆性测定。/n

【技术特征摘要】
1.一种培育抗逆杨树的方法，其包括以下步骤：
(1)材料的选择；
(2)抗逆转录因子双基因载体pBIJEAR的构建；
(3)农杆菌介导的杨树叶片的遗传转化；
(4)转基因植株的分子检测；和
(5)温室移栽及抗逆性测定。


2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(1)中所述的材料为未木质化和半木质化当年生枝条。


3.根据权利要求1或2所述的方法，其中步骤(2)中所述的构建为将来源于番茄的乙烯应答响应元件(JERF36#)和柠条的ABA响应元件结合蛋白基因(ckAREB)构建到同一植物表达载体上，从而构建JERF36-ckAREB双基因植物表达载体(pBIJEAR)，实现抗逆调控基因相对稳定串联。


4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中步骤(3)中所述的遗传转化包括：
(1)叶片侵染；
(2)共培养；和
(3)选择培养。


5.根据权利要求4所述的方法，其中所述的叶片侵染为取生长健壮的无菌苗叶片垂直于叶脉切3-4个切口，放入叶片再生培养基中，预培养1-3天，取出预培养叶盘浸入转化菌液中，侵染10-15min，期间轻微震荡，确保叶片与菌液充分接触。


6.根据权利要求4或5所述的方法，其中所述的共培养为取出叶盘，...

【专利技术属性】
技术研发人员：张冰玉，苏晓华，张伟溪，丁昌俊，武舒，钟姗辰，
申请(专利权)人：中国林业科学研究院林业研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11