一种抗菌肽及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种抗菌肽及其制备方法与应用，所述的抗菌肽包括氨基酸序列：RRWQWRGSGRWQWRR。它解决了以下几个问题：(1)现有抗生素类药物大都产生耐药性，不能有效杀灭病原菌；(2)抗菌肽天然资源有限且抗菌谱不广、产量有限、制备成本高；(3)提高了蛋白样品的抗菌活性。(4)和其它抗菌制剂联合使用，可以明显提高其抗菌活性解决了现有多肽制备技术成本高或者或者存在污染环境问题。本发明专利技术包括抗菌肽氨基酸序列及其应用，本发明专利技术制得产品可用于制备抗革兰氏阴性、阳性菌的产品以及用于生产兽药、饲料添加剂、防腐剂。

An antibacterial peptide and its preparation and Application

【技术实现步骤摘要】
一种抗菌肽及其制备方法与应用
本专利技术属于生物
，具体地涉及一种抗菌肽及其制备方法与应用。
技术介绍
抗菌肽(antimicrobialpeptides，AMPs)又称为宿主防御肽，这是一类天然或者人工合成的分子量较小的具有一定抗菌与免疫作用的多肽物质。其特殊的氨基酸组成使它具有合适的疏水性和带电荷性，因此能与病原微生物表面带负电荷的物质结合进而破坏细胞膜结构，或能进入细胞内部与核酸、蛋白质等大分子物质结合，最终扰乱细胞的正常生理功能并导致其死亡。抗菌肽的作用机制可分为两类：膜损伤和胞内损伤。其中，氨基酸序列、脂膜、肽浓度等多种因素控制着AMPs的生物活性。对抗生素的长期滥用导致超级细菌、病毒、真菌以及寄生虫等耐药病原体的大量出现，以至于缺乏有效的抗生素用于这些耐药菌的治疗。抗菌肽的特殊作用机制与抗生素不同，不易导致耐药性病原菌的产生，因而在作为新型的抗菌药物方面取得快速发展。抗菌肽，具有热稳定、水溶性好、无残留、不易产生抗药性的特点，不同抗菌肽对大肠杆菌，金黄色葡萄球菌、念珠球菌、绿脓杆菌、肠细菌、沙雷氏菌、变形杆菌、粪链球等革兰氏阴、阳性菌表现出不同的抑菌效果。因此，抗菌肽在新型抑菌药物、食品天然防腐剂及动物饲料添加剂等产品开发领域具有广阔的应用前景。许多膳食蛋白质分子中含有大量的生理活性肽，这些多肽分子在原蛋白序列中并不表现出功能，但是可以通过在胃肠道消化或在食品加工的过程中被释放。食物蛋白质来源的抗菌肽具有安全性高、人体吸收性好的特点，可以直接添加到食物中并同时具备体内体外抗菌的功效。天然抗菌肽资源有限，由于其天然结构上的限制，因氨基酸序列和分子结构的不同表现出不同抑菌效果，有效活性剂量较高，并且以化学合成获得的抗菌肽成本又较高。利用生物技术方法合成制备多肽具有活性高、生产对环境影响小的优点。但以酵母和大肠杆菌作为基因工程菌进行表达，现有技术存在得率低、成本高等问题。因此其在实际应用上受到了极大限制。因此，如何利用基因工程技术在微生物中方便、有效及低成本的生产抗菌肽成为其实际应用的关键。
技术实现思路
专利技术目的：本专利技术所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种抗菌肽。本专利技术还要解决的技术问题是提供上述抗菌肽的制备方法。本专利技术最后要解决的技术问题是提供上述抗菌肽的应用，从而提供新型、高效、无毒、无公害、稳定性好的抗菌制剂，改变当前抗生素和防腐剂滥用状况。专利技术思路：通过生物信息学的方法，在抗菌肽数据库(APD)中选择若干具有抗菌活性的抗菌肽，利用BLAST程序对溶菌酶，乳铁蛋白及其它食源性蛋白进行比对，在食品蛋白质核酸数据库中搜寻相似的同源性较高多肽序列。在分析其序列同源性基础上依据抗菌肽结构功能的关系，找出潜在的具有抗菌活性的多肽序列，并进一步通过人工设计出抗菌肽序列。为了解决上述技术问题，本专利技术公开了一种抗菌肽，所述的抗菌肽包括如SEQIDNO.1所示的氨基酸序列；SEQIDNO.1：RRWQWRGSGRWQWRR。优选地，在SEQIDNO.1所述氨基酸序列的两侧分别连接亲水性氨基酸、疏水性氨基酸、正电荷氨基酸和负电荷氨基酸中的任意一种或两种组合。更优选地，如式I所示中的任意一种：(Y)a(N)b-RRWQWRGSGRWQWRR-(X)a(M)b(X)a(N)b-RRWQWRGSGRWQWRR-(Y)a(M)b(Y)a(M)b-RRWQWRGSGRWQWRR-(X)a(N)b(X)a(M)b-RRWQWRGSGRWQWRR-(Y)a(N)bⅠ；其中，X为疏水性氨基酸，如F、I、W、L、A等；Y为亲水性氨基酸，如S、G、Y、T等；M为正电荷氨基酸，如R或K；N为负电荷氨基酸，如D或E；a和b分别代表为5-15不同长度。所述的抗菌肽列两侧加入由长度不等的带正负电荷、亲疏水性氨基酸序列，这是为了更好的适应抗菌制剂、饲料、食品防腐添加剂在油性、水性环境中使用，增强其抗菌活性和有效吸收使用率。上述的抗菌肽的制备方法也在本专利技术的保护范围之内。其中，所述的制备方法为固相多肽合成法，按其氨基酸序列合成所述抗菌肽的线性肽。其中，所述的制备方法也可以是基因工程方法，其包括如下步骤：(1)按抗菌肽的氨基酸序列合成基因序列，并将其克隆至大肠杆菌中，转入大肠杆菌宿主菌细胞内，构建重组大肠杆菌表达载体；(2)将步骤(1)构建的重组大肠杆菌表达载体再转化至宿主细胞BL21中，IPTG诱导表达后，离心收集菌体，超声波裂解，离心收集包涵体沉淀；将步骤(2)收集的包涵体沉淀进行纯化，即得。其中，所述的基因工程方法以多拷贝形式插入大肠杆菌的表达载体中，其最终得率可达20g/L发酵液以上，蛋白回收率为70％。其中，所述的基因工程方法具体的为，将溶菌酶，乳铁蛋白及其它食源性蛋白肽链序列经人工设计产生抗菌肽链，其包括如下步骤：(1)设计编码多肽的基因序列：HHHHHHSSSSGSSSS(DDDKBRRWQWRGSGRWQWRRORSSGSS)P其中，HHHHHH为镍螯合柱纯化标签；SSSSGSSSS、SSGSS为过渡肽，B、O分别代表(Y)a(N)b、(X)a(M)b、(X)a(N)b和(Y)a(M)b的任何一种，DDDK为肠激酶酶切位点，p为2-20的任意数字，代表为p数目的重复序列，a和b分别代表为5-15不同长度。以食物蛋白质来源的抗菌肽为出发点，通过生物信息学的方法，在抗菌肽数据库(APD)中选择若干具有抗菌活性的抗菌肽，利用BLAST程序对溶菌酶，乳铁蛋白及其它食源性蛋白进行比对，在此基础上设计出全新的抗菌肽及其组合。(2)人工合成上述多肽蛋白编码基因的碱基序列，并克隆至大肠杆菌表达载体构建重组大肠杆菌表达载体。将表达载体转化宿主细胞E.Col1BL21(DE3)，IPTG诱导表达后，经离心收集菌体，超声波裂解，离心收集包涵体沉淀；包涵体分别经洗涤后用2mmol/LDTT、8mol/L尿素、pH7.8充分溶解后过超滤膜收集滤液备用。镍NTA琼脂糖凝胶FF预装柱用平衡缓冲液平衡至基线，用8M脲-2mmol/LDTT-平衡缓冲液平衡至基线。将上述超滤液上样，经洗涤液洗涤后用洗脱缓冲液洗脱并收集洗脱峰，洗脱样品用SephadexG-25在50mMTris缓冲液pH7.5下条件脱盐并收集洗脱峰蛋白。将脱盐样品分别用肠激酶和胰蛋白酶进行酶切，酶切后样品用离子交换/脱盐柱、C-18反相HPLC制备柱进行纯化即得目的多肽样品。上述抗菌肽的应用也在本专利技术的保护范围之内，其中，所述的抗菌肽用作抑菌剂。其中，抗菌肽在新型抑菌药物、食品天然防腐剂及动物饲料添加剂等产品开发领域具有广阔的应用前景。优选地，所述的抗菌肽对绿脓杆菌具有较好抑菌作用；其中，所述的绿脓杆菌为ATCC27853。一种含有上述抗菌肽的多肽或蛋白质也在本专利技术的保护范围之内。一种包括上述抗菌肽及药学上可本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抗菌肽，其特征在于，所述的抗菌肽包括如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。/n

【技术特征摘要】
1.一种抗菌肽，其特征在于，所述的抗菌肽包括如SEQIDNO.1所示的氨基酸序列。


2.根据权利要求1所述的抗菌肽，其特征在于，在SEQIDNO.1所述氨基酸序列的两侧分别连接亲水性氨基酸、疏水性氨基酸、正电荷氨基酸和负电荷氨基酸中的任意一种或两种组合。


3.权利要求1所述的抗菌肽的制备方法，其特征在于，其采用固相多肽合成法，按其氨基酸序列合成所述抗菌肽的线性肽。


4.根据权利要求2所述的抗菌肽的制备方法，其特征在于，该制备方法是基因工程方法，其包括如下步骤：
(1)按抗菌肽的氨基酸序列合成基因序列，并将其克隆至大肠杆菌中，构建重组大肠杆菌表达载体；
(2)将步骤(1)构建的重组大肠杆菌表达载体再转化至宿主细胞BL21中，IPTG诱导表达后，离心收集...

【专利技术属性】
技术研发人员：戴鼎震，陈俊红，陈涛，蒋加进，方光远，陆雨楠，沙奕羽，黄翔宇，
申请(专利权)人：金陵科技学院，
类型：发明
国别省市：江苏;32