一种可提高准确率的COVID-19新型冠状病毒核酸检测方法技术

本发明专利技术涉及可提高准确率的COVID‑19新型冠状病毒核酸检测方法，先在逆转反应体系混合进行逆转反应，使得polyA的RNA在逆转录酶和oligo（dT）的帮助下逆转录成具有poly（T）的cDNA；同时对逆转后的cDNA进行RPA反应一段时间以进一步放大；对放大后的产物与QPCR体系混合，于QPCR仪上进行链式反应，分别依次进行变性再退火最后延伸的链式循环反应；通过检测设备收集检测荧光信号强度对目的片段进行定性或半定量分析测定，最后根据得到不同的荧光信号数据判断患者病毒检测结果。本技术方案能够提供一种特异性强、结果准确、假阴性概率低，同时可以对患者感染前期到后期各个阶段进行监测的可提高准确率的COVID‑19新型冠状病毒核酸检测方法。

A novel coronavirus nucleic acid detection method for COVID-19 with higher accuracy

【技术实现步骤摘要】
一种可提高准确率的COVID-19新型冠状病毒核酸检测方法
本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种可提高准确率的COVID-19新型冠状病毒核酸检测方法。
技术介绍
新型冠状病毒肺炎（“Novelcoronaviruspneumonia”，简称“NCP”）为2019新型冠状病毒（COVID-19）感染引起的急性呼吸道传染病。约半数患者多在一周后出现呼吸困难，严重者快速进展为急性呼吸窘迫综合征、脓毒症休克、难以纠正的代谢性酸中毒和出凝血功能障碍。由于新型冠状病毒传播途径包括直接传播、气溶胶传播和接触传播，因此具有较强的传染性，再加上其较长时间的潜伏期，因此给防疫工作带来了巨大的挑战。NCP是一种单链的RNA病毒，它本身并不存在RNA病毒翻译所需的核糖体体系，只有进入宿主细胞后，利用宿主的RNA翻译体系以病毒基因组RNA为翻译模板进行蛋白翻译，其中就包括一个具有多重RNA复制酶功能域的RNA聚合酶，进而是应用这个酶完成负链亚基因组RNA的转录合成、各种结构蛋白mRNA的合成，从而进行病毒基因组RNA的复制，之后与病毒结构蛋白进行组装后释放并侵染其他细胞。由此可见病毒RNA的入侵是病毒进行感染的首要步骤。本试剂盒针对NCP的病毒RNA进行检测以实现对NCP感染情况进行检测跟踪，同时也可以对预后患者是否康复进行评估。前确诊新冠肺炎的手段是采用逆转病毒RNA后再进行荧光定量PCR法针对病毒基因的核酸检测，根据目前临床实际使用情况表明现有的核酸检测存在较多的假阴性，给疫情防控带来很大的隐患，其假阴性的原因可能由于其采用病毒RNA逆转成cDNA后，进行实时荧光检测时检测灵敏度不够，从而导致其检测下限较高，检测结果存在部分误差。另外，对于新型冠状病毒（COVID-19）目前还采用胶体金检测方法，其是根据IgM、IgG类抗体是人体感染新冠病毒后产生的免疫防御蛋白，IgG是感染14天后出现的抗体，产生后持续存在，可以作为既往感染的指标，此法检测的IgG在感染后持续存在导致不能很准确的对预后患者的感染情况进行有效评估和精确健康阶段检测。
技术实现思路
本专利技术目的是为了克服现有技术的不足，包括现有荧光定量PCR法核酸检测存在较多的假阴性以及胶体金法检测无法准确的预后患者的感染情况进行评估的问题，而提供一种特异性强、结果准确、假阴性概率低，同时可以对患者感染前期到后期各个阶段进行监测的可提高准确率的COVID-19新型冠状病毒核酸检测方法。为便于对本技术方案中涉及到的专业用语的理解，现将其整理如下：COVID-19为新型冠状病毒型号命名。SSB是指单链结合蛋白(英文全称Single-StrandedDNA-BindingProtein,SSB)在DNA复制、重组和修复中起着重要作用。cDNA是指具有与某RNA链呈互补碱基序列的DNA。QPCR是英文全名Real-timeQuantitativePCRDetectingSystem的简称，是指实时荧光定量核酸扩增检测系统，也叫实时定量基因扩增荧光检测系统。引物，是指在核苷酸聚合作用起始时，刺激合成的一种具有特定核苷酸序列的大分子，与反应物以共价键形式连接，这样的分子称为引物。引物通常是人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引物与靶区域一端的一条DNA模板链互补，另一个引物与靶区域另一端的另一条DNA模板链互补，其功能是作为核苷酸聚合作用的起始点，核酸聚合酶可由其3端开始合成新的核酸链。脱氧核糖核苷酸是由一分子的含氮的碱基,一分子的脱氧核糖,一分子的磷酸构成的，其中核糖的5'位有个磷酸,为磷酸端,3'位是-OH（羟基）,是羟基端，DNA能够连接就是前一个脱氧核糖核苷酸的羟基端与后一个的磷酸端相连。mRNA的3'端有一段多聚腺苷酸(即polyA)尾巴，长20～300个腺苷酸。该尾巴与mRNA由细胞核向细胞质的移动有关，也与mRNA的半衰期有关。研究发现，polyA的长短与mRNA寿命呈正相关’刚合成的mRNA寿命较长，“老”的mRNA寿命较短；转录第一步合成的mRNA是不成熟的,需要在5‘端加上磷酸集团的帽子,主要是为后面的翻译的识别和起始有关的,在3‘端加上polyA(多聚A)的尾巴,防止合成的mRNA被降解掉,所以对mRNA的稳定性有着非常重要的意义,另外还有内含子的剪切等等,才可以称为成熟mRNA。poly是指多聚腺嘌呤核糖核苷酸。Oligo(dT)是多聚胸腺嘧啶、T重复寡核苷酸，就是只有胸腺嘧啶组成的核苷酸链，仅产生所需要的cDNA，用Oligo(dT)特异结合到mRNA上Poly(A)尾端，以此可以特异地将mRNA从总RNA中分离出来。phi29DNA聚合酶是从Bacillussubtilis噬菌体phi29中克隆出的嗜温DNA聚合酶。具有3'到5'外切酶校读能力，并且具有特殊的多重置换和连续合成特性。Ct值的其中C代表Cycle，t代表threshold，具体是指每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。p值是指统计学中通俗理解为拒绝原假设要冒的风险程度，值越小，就表示风险越小，P值就是当原假设为真时，比所得到的样本观察结果更极端的结果出现的概率。为达到上述目的，本专利技术采用了如下技术方案。一种可提高准确率的COVID-19新型冠状病毒核酸检测方法，具体包括如下步骤：步骤S1：将适量核酸提取液作为待测样品与逆转反应体系混合进行逆转反应，逆转反应体系包括RNA逆转录酶、能结合单链核酸的重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶，使得具有3’末端polyA的RNA在逆转录酶和oligo（dT）的帮助下逆转录成具有poly（T）的cDNA；步骤S2：同时对逆转后的cDNA进行RPA反应一段时间以进一步放大，采用重组酶与引物结合形成的蛋白-DNA复合物，在双链DNA中寻找同源序列，引物在定位到同源序列后发生链交换反应形成并启动DNA合成，对模板上的目标区域进行指数式扩增，被替换的DNA链与单链DNA结合蛋白结合防止进一步替换；步骤S3：对所述步骤S2中扩增后的目标产物，其中R为荧光基团，Q为淬灭基团，当Q与R靠近时探针不发光，热变性将DNA双链进行分离，退火时引物与单链DNA结合；步骤S4：DNA聚合酶随后与引物和单链RNA组成的双链结合，在延伸温度下进行DNA聚合酶启动延伸，DNA聚合酶具有外切酶活性，当其延伸至探针荧光端时将荧光基团及探针核苷酸切除，这样就使得荧光基团与淬灭基团分离；步骤S5：对放大后的产物与QPCR体系混合，于QPCR仪上进行链式反应，分别依次进行变性再退火最后延伸的链式循环反应；步骤S6：通过检测设备收集检测荧光信号强度对目的片段进行定性或半定量分析测定，最后根据得到不同的荧光信号数据判断患者病毒检测结果。作为本专利技术的进一步改进，所述步骤S2中的引物采用寡核苷酸引物。作为本专利技术的进一步改进，所述步骤S2中双链DNA是指引物与模板cDNA结合后双链。作为本专利技术的进一本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种可提高准确率的COVID-19新型冠状病毒核酸检测方法，其特征在于，具体包括如下步骤：/n步骤S1：将适量核酸提取液作为待测样品与逆转反应体系混合进行逆转反应，逆转反应体系包括RNA逆转录酶、能结合单链核酸的重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶，使得具有3’末端polyA的RNA在逆转录酶和oligo（dT）的帮助下逆转录成具有poly（T）的cDNA；/n步骤S2：同时对所述步骤S1中逆转后的cDNA进行RPA反应一段时间以进一步放大，采用重组酶与引物结合形成的蛋白-DNA复合物，在双链DNA中寻找同源序列，引物在定位到同源序列后发生链交换反应形成并启动DNA合成，对模板上的目标区域进行指数式扩增，被替换的DNA链与单链DNA结合蛋白结合防止进一步替换；/n步骤S3：对所述步骤S2中扩增后的目标产物，其中R为荧光基团，Q为淬灭基团，当Q与R靠近时探针不发光，利用热变性将DNA双链进行分离，退火时引物与单链DNA结合；/n步骤S4：DNA聚合酶随后与引物和单链RNA组成双链结合，在延伸温度下进行DNA聚合酶启动延伸，DNA聚合酶具有外切酶活性，当其延伸至探针荧光端时将荧光基团及探针核苷酸切除，这样就使得荧光基团与淬灭基团分离；/n步骤S5：对放大后的产物与QPCR反应体系混合，在QPCR仪上进行链式反应，分别依次进行变性再退火最后延伸的链式循环反应；/n步骤S6：通过检测设备收集检测荧光信号强度对目的片段进行定性或半定量分析测定，最后根据得到不同的荧光信号数据判断患者病毒检测结果。/n...

【技术特征摘要】
1.一种可提高准确率的COVID-19新型冠状病毒核酸检测方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
步骤S1：将适量核酸提取液作为待测样品与逆转反应体系混合进行逆转反应，逆转反应体系包括RNA逆转录酶、能结合单链核酸的重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶，使得具有3’末端polyA的RNA在逆转录酶和oligo（dT）的帮助下逆转录成具有poly（T）的cDNA；
步骤S2：同时对所述步骤S1中逆转后的cDNA进行RPA反应一段时间以进一步放大，采用重组酶与引物结合形成的蛋白-DNA复合物，在双链DNA中寻找同源序列，引物在定位到同源序列后发生链交换反应形成并启动DNA合成，对模板上的目标区域进行指数式扩增，被替换的DNA链与单链DNA结合蛋白结合防止进一步替换；
步骤S3：对所述步骤S2中扩增后的目标产物，其中R为荧光基团，Q为淬灭基团，当Q与R靠近时探针不发光，利用热变性将DNA双链进行分离，退火时引物与单链DNA结合；
步骤S4：DNA聚合酶随后与引物和单链RNA组成双链结合，在延伸温度下进行DNA聚合酶启动延伸，DNA聚合酶具有外切酶活性，当其延伸至探针荧光端时将荧光基团及探针核苷酸切除，这样就使得荧光基团与淬灭基团分离；
步骤S5：对放大后的产物与QPCR反应体系混合，在QPCR仪上进行链式反应，分别依次进行变性再退火最后延伸的链式循环反应；
步骤S6：通过检测设备收集检测荧光信号强度对目的片段进行定性或半定量分析测定，最后根据得到不同的荧光信号数据判断患者病毒检测结果。


2.根据权利要求1所述的一种可提高准确率的COVID-19新型冠状病毒核酸检测方...

【专利技术属性】
技术研发人员：童坤，乔森，肖潇，黄磊，张硕，
申请(专利权)人：南京申基医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32