一种检测SARS-COV-2病毒的恒温扩增试剂盒及引物探针组制造技术

本发明专利技术公开一种检测SARS‑COV‑2病毒的恒温扩增试剂盒及引物探针组，试剂盒包括（1）灭活裂解液；（2）恒温扩增体系：反应缓冲液BufferA、醋酸镁BufferB、阴性对照、无核酸酶水、引物探针组和RAA酶。通过裂解液快速灭活并释放病毒核酸，并利用恒温扩增技术，快速富集并扩增目的区域，通过带有修饰基团的探针与带有生物素的产物结合，通过侧向层析技术，利用胶体金显色，快速确认是否存在特异性扩增产物。该试剂盒操作简单，无需专业抽提试剂和检测仪器，摆脱了检测实验室和专业人员的限制，可以在户外无仪器状态下进行快速检测，全流程仅需30min，判读非常方便。

A constant temperature amplification kit and primer probe set for detection of sars-cov-2 virus

【技术实现步骤摘要】
一种检测SARS-COV-2病毒的恒温扩增试剂盒及引物探针组
本专利技术属于生物
，更具体地说，涉及一种针对SARS-COV-2病毒定性检测的恒温扩增检测试剂盒。
技术介绍
2019年武汉发现的新型冠状病毒(SARS-CoV-2)是一种之前尚未在人类中发现的新型病毒，属于SARS样冠状病毒种，但是与SARS-CoV属于不同毒株。新型冠状病毒感染的肺炎(CoronaVirusDisease2019，简称COVID-19)，简称新冠肺炎，是经呼吸道传播的由新型冠状病毒(SARS-CoV-2)引起的一种传染病。新型冠状病毒检测需要在专业的PCR实验室内，由专业人员使用昂贵的抽提和检测仪器进行检测，耗时至少3个小时，并且结果判读较为困难，每日检测量受到限制，基层医疗单位无法第一时间确诊，导致交叉感染和病情延误的情况。并且，早期使用的核酸检测试剂盒对于已确诊的病人阳性率也只在30％—50％之间，给疫情确诊和控制带来了一定困难。核酸恒温扩增技术是继PCR技术后近年发展起来得一种新的体外核酸扩增技术，其特点为扩增反应的全过程均在单一温度进行，反应时间大大缩短，结合核酸试纸条显色来判定检测结果，整个反应过程不打开反应管盖子，试纸条检测过程密闭，减少核酸扩增产物污染的可能性。针对新发现病毒的恒温扩增检测试剂盒，选择合适的灭活裂解液，以及引物探针的选择尤为关键，目前尚没有针对SARS-COV-2病毒的恒温扩增检测试剂盒公开。
技术实现思路
针对现有技术存在的不足，本专利技术第一个目的在于提供一种快速、准确、无仪器依赖的检测SARS-COV-2病毒的恒温扩增引物探针组。本专利技术第二个目的在于提供引物探针组在制备检测SARS-COV-2病毒的恒温扩增试剂盒中的应用。本专利技术第三个目的在于提供一种快速、准确、无仪器依赖的检测SARS-COV-2病毒的恒温扩增试剂盒。为实现上述第一个目的，本专利技术提供了如下技术方案：一种检测SARS-COV-2病毒的恒温扩增引物探针组，正向引物为：5’-gatccacagacacttgagattcttgacattac-3’(SEQIDNO.1)；反向引物为：5’-cattagaacctgtagaataaacacgccaag-3’(SEQIDNO.2)；探针序列为：5’-AACAAATACTTCTAACCAGGTTGCTGTTCTT/idsp/ATCAGGATGTTAACT-3’block(SEQIDNO.3)，其中5’端标记抗原基团，3’端连接封闭基团。通过在探针序列的5′端增加抗原基因，包括但不限于修饰基团FAM发光基团，FITC，地高辛等，用于和抗体结合，第31位碱基后连接脱碱基位点四氢呋喃(Tetrahydrofuran，THF)进行修饰，在探针3’端连接封闭基团阻断修饰，包括但不限于C3-Spacer，biotin-TEG，phosphate等。探针序列优选5′端标记FAM发光基团，第31位碱基后连接脱碱基位点四氢呋喃(Tetrahydrofuran，THF)进行修饰，3′端进行C3-spacer阻断修饰。在反向引物5’端增加biotin进行修饰。反应终产物在5’端带有抗原标记，3’端带有生物素。为实现上述第二个目的，本专利技术提供了如下技术方案：所述检测SARS-COV-2病毒的恒温扩增引物探针组在制备检测SARS-COV-2病毒的恒温扩增试剂盒中的应用。为实现上述第三个目的，本专利技术提供了如下技术方案：一种检测SARS-COV-2病毒的恒温扩增试剂盒，所述试剂盒包括：(1)灭活裂解液；(2)恒温扩增体系：反应缓冲液BufferA、醋酸镁BufferB、阴性对照、无核酸酶水、引物探针组和RAA酶。所述引物探针组为，正向引物为：5’-gatccacagacacttgagattcttgacattac-3’(SEQIDNO.1)；反向引物为：5’-cattagaacctgtagaataaacacgccaag-3’(SEQIDNO.2)；探针序列为：5’-AACAAATACTTCTAACCAGGTTGCTGTTCTT/idsp/ATCAGGATGTTAACT-3’block(SEQIDNO.3)，其中5’端标记抗原基团，3’端连接封闭基团。作为一个优选方案，所述灭活裂解液包括摩尔浓度为0.01-0.1M的NaOH，体积比为0.1％-0.5％的TWEEN-20，体积比为0.1％-1％的TritonX-100。作为进一步优选方案，所述灭活裂解液包括摩尔浓度为0.01M的NaOH，体积比为0.5％的TWEEN-20，体积比为0.1％的TritonX-100。通过灭活裂解液对口腔拭子样本进行快速灭活，并裂解病毒细胞，释放出核酸。自制灭活裂解液中非离子表面活性剂高效结合病毒表面蛋白，破坏病毒结构，弱碱性溶液进一步破坏细胞结构，释放核酸。作为一个优选方案，所述恒温扩增体系中引物探针组和RAA酶制成干粉态。作为一个优选方案，将正向引物为：5’-gatccacagacacttgagattcttgacattac-3’(SEQIDNO.1)400nm，反向引物为：5’biotin-cattagaacctgtagaataaacacgccaag-3’(SEQIDNO.2)400nm，探针：FAM-AACAAATACTTCTAACCAGGTTGCTGTTCTT/idsp/ATCAGGATGTTAACT/3‘block120nm与反应所需的RAA酶一起，制成干粉态，储于干粉反应管，便于保存和操作。作为一个优选方案，RAA酶、bufferA和buffeB采购自杭州众测生物。所述RAA酶包括逆转录酶，链置换DNA聚合酶，重组酶，单链DNA结合蛋白，NFO酶。作为一个优选方案，所述BufferA包括摩尔浓度为50mM的TrispH8.4,80mM的Potassiumacetate,10mM的Magnesiumacetate,1mM的DTT,3mM的ATP，20mM的Phosphocreatine,100ng/ul的Creatinekinase和质量浓度为5％的PEGcompound(Carbowax-20M，molecularcrowdingagents拥挤剂)。作为一个优选方案，所述BufferB包括摩尔浓度为250mM的醋酸镁。作为一个优选方案，所述试剂盒还包括核酸检测试纸条(购自杭州优思达生物技术公司)。试剂盒还包括一次性核酸检测装置(购自杭州优思达生物技术公司)，使用核酸检测试纸条检测，结合了重组酶聚合酶扩增技术和胶体金显色技术，在配置好的弱碱性非离子表面活性剂的处理下，RNA病毒可以较为高效的进行裂解，且该体系对对后续重组等温扩增体系影响较小，可以直接加入反应体系中而无需纯化。重组酶与引物结合形成的蛋白-DNA复合物，能在双链DNA中寻找同源序列并链交换反应形成并启动DNA合成，对模板上的目标区域进行扩增。被替换的DNA链与SSB结合，防本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测SARS-COV-2病毒的恒温扩增引物探针组，其特征在于，/n正向引物为：5’-gatccacagacacttgagattcttgacattac-3’；/n反向引物为：5’-cattagaacctgtagaataaacacgccaag-3’；/n探针序列为：5’-AACAAATACTTCTAACCAGGTTGCTGTTCTT/idsp/ ATCAGGATGTTAACT-3’block，其中5’端标记抗原基团，3’端连接封闭基团。/n

【技术特征摘要】
1.一种检测SARS-COV-2病毒的恒温扩增引物探针组，其特征在于，
正向引物为：5’-gatccacagacacttgagattcttgacattac-3’；
反向引物为：5’-cattagaacctgtagaataaacacgccaag-3’；
探针序列为：5’-AACAAATACTTCTAACCAGGTTGCTGTTCTT/idsp/ATCAGGATGTTAACT-3’block，其中5’端标记抗原基团，3’端连接封闭基团。


2.权利要求1所述检测SARS-COV-2病毒的恒温扩增引物探针组在制备检测SARS-COV-2病毒的恒温扩增试剂盒中的应用。


3.一种检测SARS-COV-2病毒的恒温扩增试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
（1）灭活裂解液；
（2）恒温扩增体系：反应缓冲液BufferA、醋酸镁BufferB、阴性对照、无核酸酶水、权利要求1所述引物探针组和RAA酶。


4.根据权利要求3所述一种检测SARS-COV-2病毒的恒温扩增试剂盒，其特征在于，所述灭活裂解液包括摩尔浓度为0.01-0.1M的NaOH，体积比为0.1%-0.5%的TWEEN-20，体积比0.1%-1%的TritonX-100。


5.根据权利要求4所述一种检测SARS-COV-2病毒的恒温扩增试...

【专利技术属性】
技术研发人员：方圆，宋泽世，蔡青青，郏肯特，田西西，
申请(专利权)人：上海迪飞医学检验实验室有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31