一种致病性大肠杆菌噬菌体口服制剂及其制备方法技术

本发明专利技术从养殖场环境中分离得到一株对于致病性大肠杆菌ETEC‑K88ac具有强裂解作用的噬菌体Phage‑HY19，并将其加工成为口服制剂，该口服制剂对引起动物腹泻的主要病原ETEC‑K88ac具有宿主范围广的特点，且所述的噬菌体制品是无毒的，可以安全地用于动物腹泻的预防和治疗中，由于采用噬菌体特异性裂解ETEC‑K88ac，能够避免抗生素使用中所导致的ETEC‑K88ac进化和耐药毒株的产生。

【技术实现步骤摘要】
一种致病性大肠杆菌噬菌体口服制剂及其制备方法
：本专利技术涉及一种致病性大肠杆菌噬菌体口服制剂及其制备方法，属于生物

技术介绍
：致病性大肠杆菌是引起动物腹泻常见病原，在临床治疗中以抗生素治疗为主，而近年来，对于动物腹泻的临床治疗工作中使用抗生素方面往往不谨慎不合理，使得大肠杆菌具有耐药性且耐药现象越来越严重，大肠杆菌病的防治越来越难。随着多重耐药菌株的层出不穷以及耐药性转移等弊端的出现，寻找有效、绿色、安全、无公害的抗菌或抑菌制剂替代抗生素控制致病性大肠杆菌势在必行。噬菌体是一类细菌依赖性的病毒，裂解性噬菌体感染细菌后，可在宿主菌内快速增殖，并使之裂解。噬菌体在溶解其特异性宿主细菌时十分有效，且杀死细菌的机制与抗生素不同，不易产生耐药性和残留，十分适合成为理想的新型抗菌剂，此外，噬菌体制剂特异性强、潜伏期短、吸附率高等优点。因此，用噬菌体来治疗感染是一个很有前途的抗感染治疗新途径。近年来噬菌体制剂的研究受到普遍关注，例如专利技术专利ZL200910029306.9涉及江苏省农科院研发的一种福氏志贺氏菌噬菌体菌株，该菌株对福氏志贺氏菌有强的裂解作用；专利技术专利ZL2009102632950同样由江苏省农科院分离得到一种产肠毒素性大肠杆菌的噬菌体EK99-C，用于幼畜腹泻治疗、细菌感染以及环境净化消毒方面的应用；专利技术专利ZL201510226544.4涉及由韩国尹特荣生物科技株式会社分离得到的对大肠杆菌具有广泛抗菌活性的噬菌体即噬菌体EK88P-1为有效成份包含的组合物及利用该组合物防止及处理大肠杆菌感染的方法。然而，现在对于致病性大肠杆菌具有裂解作用的噬菌体及相关的噬菌体制剂产品并不丰富，难以满足市场需求。
技术实现思路
：针对上述问题，本专利技术旨在提供一种致病性大肠杆菌噬菌体口服制剂及其制备方法，所述制剂可以有效裂解产肠毒素型大肠杆菌K88ac，用于制备防治产肠毒素型大肠杆菌所导致的腹泻的药物，特别是由产肠毒素型大肠杆菌K88ac所导致的动物腹泻。为解决以上技术问题，丰富噬菌体制剂的种类，本专利技术采用如下技术方案。一种致病性大肠杆菌噬菌体口服制剂，其特征在于，所述口服制剂由噬菌体、多孔淀粉和海藻酸钠等主要原料制备而成。优选的，所述的致病性大肠杆菌噬菌体口服制剂中的噬菌体为噬菌体菌株Phage-HY19，分类命名：T4-like噬菌体T-evens亚群，所述菌株已于2019年04月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，其保藏号为CGMCCNo.17584。优选的，所述噬菌体菌株对于产肠毒素型大肠杆菌ETEC-K88ac具有强的裂解作用。优选的，所述的致病性大肠杆菌噬菌体口服制剂的制备方法包括如下步骤：步骤一，噬菌体悬液的制备：将噬菌体Phage-HY19按最佳MOI加入到培养至对数生长期的宿主菌E.coli-HuNHY19（保藏号为CGMCCNo.17622，分类命名：大肠埃希氏菌（Escherichiacoli））培养液中，再加入CaCl2至终浓度1mM，37℃，150rpm摇振培养12h，12000×g，4℃，离心10min，取上清，上清液经0.22μm的无菌滤器过滤，而后加入MgSO4溶液至终浓度2mM，调整滴度至3×108pfu/mL，得到噬菌体悬液；步骤二，向步骤一制备得到的噬菌体悬液中加入其体积30%的多孔淀粉，室温下搅拌均匀，得到悬浮液；步骤三，将步骤二的悬浮液与等体积的质量浓度为3%的海藻酸钠溶液混合，充分混匀后，加入步骤二的悬浮液体积5%的CaCl2溶液，充分混匀后经喷雾干燥设备脱水，制剂粒径分布在15-50μm，制备得到致病性大肠杆菌噬菌体口服制剂。本专利技术还请求保护一种致病性大肠杆菌噬菌体口服制剂的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：步骤一，噬菌体悬液的制备：将噬菌体Phage-HY19按最佳MOI加入到培养至对数生长期的宿主菌E.coli-HuNHY19（保藏号为CGMCCNo.17622）培养液中，再加入CaCl2至终浓度1mM，37℃，150rpm摇振培养12h，12000×g，4℃，离心10min，取上清，上清液经0.22μm的无菌滤器过滤，而后加入MgSO4溶液至终浓度2mM，调整滴度至4×108pfu/mL，得到噬菌体悬液；步骤二，向步骤一制备得到的噬菌体悬液中加入其体积30%的多孔淀粉，室温下搅拌均匀，得到悬浮液；步骤三，将步骤二的悬浮液与等体积的质量浓度为3%的海藻酸钠溶液混合，充分混匀后，加入步骤二的悬浮液体积5%的CaCl2溶液（质量浓度为5%），充分混匀后经喷雾干燥设备脱水，制剂粒径分布在15-50μm，制备得到致病性大肠杆菌噬菌体口服制剂。本专利技术还请求保护所述致病性大肠杆菌噬菌体口服制剂在制备用于动物腹泻的药物中的应用。所述腹泻是由产肠毒素型大肠杆菌ETEC-K88ac感染所导致的仔猪腹泻。基于以上技术方案，本专利技术具有如下优点和有益效果：本专利技术从养殖场环境中分离得到一株对于ETEC-K88ac具有强裂解作用的噬菌体Phage-HY19，并将其加工成为口服制剂，该口服制剂对引起动物腹泻的主要病原ETEC-K88ac具有宿主范围广的特点，且所述的噬菌体制品是无毒的，可以安全地用于动物腹泻的预防和治疗中，由于采用噬菌体特异性裂解ETEC-K88ac，能够避免抗生素使用中所导致的ETEC-K88ac进化和耐药毒株的产生。附图说明图1：Phage-HY19噬菌斑图，A，接种后12h；B，接种后24h；C，接种后48h。图2：噬菌体最佳感染复数（MOI）的测定结果图。图3：Phage-HY19噬菌体温度敏感性测定结果图。图4：Phage-HY19噬菌体体外杀菌活性，其中：组1，E.coli-HuNHY19+Phage-HY19；组2，E.coli-HuNHY19+PBS；组3：CVCC1524+Phage-HY19；组4：CVCC1524+PBS。具体实施方式实施例1：产肠毒素型大肠杆菌K88噬菌体的分离及纯化1.噬菌体的分离：2016年7月在衡阳市郊某中型养殖场，在2个月内连续出现多栏仔猪发生严重腹泻，且经抗生素治疗未能控制病情，死亡率高达20%，经分离得到一株强毒性的产肠毒素型大肠杆菌E.coli-HuNHY19，于2019年04月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，其保藏号为CGMCCNo.17622。经分型鉴定，E.coli-HuNHY19为O8：K91，K88ac，表明主要流行的致病性大肠杆菌为产肠毒素型大肠杆菌K88。对此，进一步在该猪场的污水处理系统排放口采集污水样品，用纱布过滤除去大颗粒杂质，而后12000×g离心10分钟后取上清液用0.22μm孔径的无菌滤器过滤，将滤液置于4℃备用。将经分离鉴定的产肠毒素型大肠杆菌E本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种致病性大肠杆菌噬菌体口服制剂，其特征在于，所述口服制剂由噬菌体、多孔淀粉和海藻酸钠等主要原料制备而成；所述噬菌体为噬菌体菌株Phage-HY19，所述菌株已于2019年04月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，其保藏号为CGMCC No.17584。/n

【技术特征摘要】
1.一种致病性大肠杆菌噬菌体口服制剂，其特征在于，所述口服制剂由噬菌体、多孔淀粉和海藻酸钠等主要原料制备而成；所述噬菌体为噬菌体菌株Phage-HY19，所述菌株已于2019年04月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，其保藏号为CGMCCNo.17584。


2.根据权利要求1所述的致病性大肠杆菌噬菌体口服制剂，其特征在于，所述噬菌体菌株对于产肠毒素型大肠杆菌ETEC-K88ac具有强的裂解作用。


3.根据权利要求1所述的致病性大肠杆菌噬菌体口服制剂，其特征在于，所述的致病性大肠杆菌噬菌体口服制剂的制备方法包括如下步骤：
步骤一，噬菌体悬液的制备：将噬菌体Phage-HY19按最佳MOI加入到培养至对数生长期的宿主菌E.coli-HuNHY19（保藏号为CGMCCNo.17622）培养液中，再加入CaCl2至终浓度1mM，37℃，150rpm摇振培养12h，12000×g，4℃，离心10min，取上清，上清液经0.22μm的无菌滤器过滤，而后加入MgSO4溶液至终浓度2mM，调整滴度至4×108pfu/mL，得到噬菌体悬液；
步骤二，向步骤一制备得到的噬菌体悬液中加入其体积30%的多孔淀粉，室温下搅拌均匀，得到悬浮液；
步骤三，将步骤二的悬浮液与等体积的质量浓度为3%的海藻酸钠溶液混合，充分混匀后，加入步骤二的悬浮液体积5%的CaCl2溶液（质量浓度为5%），充分混匀后经喷雾干燥设备脱水，制剂粒径分布在15-50μm，制...

【专利技术属性】
技术研发人员：唐青海，杨海，阳坤，滕威，杨灿，王芳宇，易诚，何丽芳，刘会敬，唐姣玉，曹丽敏，唐斯萍，
申请(专利权)人：衡阳师范学院，
类型：发明
国别省市：湖南;43