用于测量细胞器中谷胱甘肽的实时荧光成像传感器及其制备方法技术

本发明专利技术涉及一种用于测量细胞器中谷胱甘肽的实时荧光成像传感器及其制备方法。更具体地，本发明专利技术涉及用于测量细胞器中的谷胱甘肽的新型化合物，制备该新型化合物的方法，用于测量细胞器中的谷胱甘肽的实时成像传感器，所述传感器包含该新型化合物，所述传感器的制备方法，以及一种使用所述成像传感器测量细胞器中谷胱甘肽的方法。包含根据本发明专利技术的化合物的组合物的使用使得可以测量活细胞特别是干细胞中的细胞器线粒体或高尔基体的抗氧化能力，从而可以基于细胞器的抗氧化能力的测量筛选高活性干细胞。

A real-time fluorescence imaging sensor for measuring glutathione in organelles and its preparation

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于测量细胞器中谷胱甘肽的实时荧光成像传感器及其制备方法
本专利技术涉及用于测量细胞器中谷胱甘肽的实时荧光成像传感器及其制备方法。更具体地，本专利技术涉及一种用于测量细胞器中谷胱甘肽的新型化合物，制备该化合物的方法，包括该新型化合物的用于测量细胞器中谷胱甘肽的实时荧光成像传感器，成像传感器的制备方法，以及通过使用成像传感器测量细胞器中谷胱甘肽的方法。
技术介绍
人体通过抗氧化剂系统的活性适当消除活性氧(ROS)来维持体内平衡。但是，当ROS的产生与抗氧化剂系统的活性之间的平衡被打破时，氧化应激会增加，由于它是衰老、与年龄有关的变性疾病(如变性关节炎、白内障、阿尔茨海默氏病等)各种癌症、纤维化疾病和代谢综合症(例如糖尿病)、肥胖症、心血管疾病等发展的主要共同原因而引起人们的关注。所述的ROS是不稳定的高反应性分子，其氧化生物分子以引起生化和生理损伤，这是衰老的主要机制之一。因此，不仅人体的氧化程度，而且抗氧化或抗氧化活性的程度也可以用作测量生物年龄的主要生物标记。同时，间充质干细胞是源自各种成年细胞的多能干细胞，例如骨髓细胞()、脐带血细胞、胎盘细胞(或胎盘组织细胞)、脂肪细胞(或脂肪组织细胞)等。例如，源自骨髓的间充质干细胞具有分化为脂肪组织、骨/软骨组织和肌肉组织的多能性，因此已经进行了关于使用间充质干细胞开发细胞治疗剂的各种研究。然而，作为细胞治疗剂主要成分的干细胞在分离后的培养过程中往往会失去其多能性和组织再生能力并老化，并且当这些细胞经过数次传代而获得大量的细胞(相当于治疗有效量)时，这种风险变得更大。另外，从组织获得的干细胞的数量非常少，并且这些干细胞使用时需要大量，因此需要进行培养增加干细胞的数量。近年来，随着通过测量干细胞的抗氧化活性来管理干细胞质量的方法的出现，细胞内抗氧化活性的测量方法也被公开(韩国专利号10-1575846；韩国专利申请公开号2004-0030701)；LiuHongyan等人，细胞疗法(Cytotherapy)，14(2)；162-172，2012)。然而，对于通过测量干细胞的抗氧化活性来筛选具有高活性的高质量干细胞的方法的研究仍然不足。因此，干细胞是具有高稀缺价值的细胞治疗资源，为了提高干细胞的利用效率，需要开发用于抗氧化活性测量的组合物，这是筛选高活性干细胞所必需的。此外，如上所述，在测定细胞(包括干细胞)的抗氧化活性时，生物样品中含硫醇化合物的检测和鉴定是非常重要的。因此，已经开发了有效检测活细胞中的硫醇而不破坏细胞的荧光方法。然而，需要通过测量细胞中各种来源的硫醇来测量抗氧化活性的化合物。【公开】【技术问题】本专利技术人发现，根据本专利技术的MitoFreSH-示踪剂(线粒体荧光实时SH基-示踪剂)或GolgiFreSH-示踪剂(高尔基体荧光实时SH基-示踪剂)的荧光强度根据线粒体或高尔基体中硫醇的量持续地、成比例地和可逆地增加或降低，使得MitoFreSH-示踪剂或GolgiFreSH-示踪剂作为高灵敏度生物传感器有效地实时定量或定性检测活细胞中线粒体或高尔基体中硫醇的量，从而完成了本专利技术。因此，本专利技术的目的是提供由以下式III至V中的任何一个或多个所示的MitoFreSH-示踪剂(线粒体荧光实时SH基-示踪剂)或由以下式VII至IX中的任何一个或多个所示的GolgiFreSH-示踪剂(高尔基体荧光实时SH基-示踪剂)。本专利技术的另一个目的是提供一种用于检测线粒体硫醇的组合物，其包含MitoFreSH-示踪剂(线粒体荧光实时SH基-示踪剂)，或用于检测高尔基体中硫醇的组合物，其包含GolgiFreSH示踪剂(高尔基体荧光实时SH基-示踪剂)。本专利技术的又一目的是提供通过使用MitoFreSH-示踪剂或GolgiFreSH-示踪剂，在活细胞的线粒体或高尔基体中筛选硫醇增强剂或抑制剂的方法。通过以下对本专利技术的详细描述和所附权利要求，本专利技术的这些和其他目的和优点将变得更加明显。然而，本专利技术要实现的目的不限于上述目的，本领域技术人员将从以下描述中清楚地理解本专利技术的其他目的。【技术方案】在下文中，本文描述的各种实施例参考附图进行描述。在下面的描述中，阐述了许多具体细节，例如具体的结构、组合和制备方法等，以便于对本专利技术透彻理解。然而，可以在没有一个或多个这些具体细节或与其他已知方法和结构相结合的情况下实现某些实施例。在其他情况下，没有特别详细地描述已知的方法和制备工艺，以免不必要地混淆本专利技术。在整个说明书中，参考“一个实施方案”或“一实施方案”是指与该实施方案描述相关的特定特征、结构、组成或特性包括在本专利技术的至少一个实施方案中。因此，在整个说明书中各处出现的短语“在一个实施方案中”或“一实施方案”不一定是指本专利技术的相同实施例。另外，在一个或多个实施方案中，可以以任何合适的方式组合特定的特征、结构、组合或特性。除非说明书中另有说明，否则说明书中使用的所有科学和技术术语具有与本专利技术所属
的技术人员通常理解的相同含义。如本文所用，术语“比率(ratiometric)”是指输出与输入成正比。具体地，在本专利技术的一个实施方案中，术语“比率”是指本专利技术组合物的荧光强度或荧光强度的比例的增加或降低与硫醇的输入成正比。如本文所用，术语“检测”是指测量样品中化学种类或生物物质的存在或水平。如本文所用，术语“可逆的”是指化学反应中反应物和产物的混合物产生平衡混合物的状态，更具体地，术语“可逆的”是指本文中由式I所示的化合物可以与硫醇以平衡状态在正向或反向上与硫醇可逆地反应，这取决于硫醇的量。如本文所用，术语“硫醇”是指含有碳键合巯基的有机化合物。术语“硫醇(thiol)基”与术语“巯基(sulfhydryl)”可互换使用。根据本专利技术的一个方面，本专利技术提供了一种用于检测线粒体中硫醇的组合物，其包含由下式I所示的化合物或其盐：式I其中，R1为含有一个或多个N原子的3至7元杂环烷基，其中，杂环烷基具有与其键合的R2取代基，其中，R2为-(C(＝O)NH)-(CH2)m-PPh3+Cl-(其中，m为1到4的整数)、-(CH2)n-PPh3+Cl-(其中，n为1到6的整数)或-(C(＝O)-(CH2)p-R3(其中p为1-4的整数)，其中，R3为-C(NHC(＝O)-R4)，其中，R4为由以下式II所示的取代基：式II其中，x为1至4的整数。本专利技术人做了大量的努力，开发了用于定量或定性地实时检测细胞中线粒体中硫醇的量的高灵敏度生物传感器。结果，本专利技术人发现，根据本专利技术的由式I所示的MitoFreSH-示踪剂(线粒体荧光实时SH基-示踪剂)的荧光强度根据细胞线粒体中硫醇的量持续地、成比例地和可逆地增加或降低，使得MitoFreSH-示踪剂作为高灵敏度生物传感器有效地实时定量或定性检测活细胞线粒体中硫醇的量，从而完成了本专利技术。如本文所用，术语“MitoFreSH-示踪剂(线粒体荧光实时SH基-示踪剂)是指由式I所示的化合物本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.由以下式I所示的化合物或其药学上可接受的盐：/n[式I]/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170824 KR 10-2017-01074291.由以下式I所示的化合物或其药学上可接受的盐：
[式I]



其中，R1为N或含有一个或多个N原子的3至7元杂环烷基。


2.如权利要求1所述的式1所示的化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述杂环烷基具有键合至其上的R2取代基，其中，R2为-(C(＝O)NH)-(CH2)m-PPh3+Cl-(其中，m为1至4的整数)、-(CH2)n-PPh3+Cl-(其中，n为1至6的整数)或-C(NHC(＝O)-R3，其中，R3为由以下式II所示的取代基：
[式II]



其中，x为1至5的整数。


3.如权利要求2所述的式1所示的化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述式I所示的化合物为下述式III至V所示的化合物中的任意一种或多种：
[式III]



[式IV]



[式V]





4.如权利要求1所述的式1所示的化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，式I所示的化合物中R1为N，且式I如以下式VI所示：
[式VI]



其中，R4为((CH2)p-(OCH2CH2O)q-(CH2)r或-(CH2CH2)s-，其中，p、q、r和s均为1至5的整数。


5.如权利要求4所述的式1所示的化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，R4为(OCH2CH2O)-、-(CH2CH2)-或-(CH2(OCH2CH2)2OCH2)-中的任一种，且所述式1所示的化合物由以下式VII至IX中的任何一个或多个所示：
[式VII]



[式VIII]



[式IX]





6.如权利要求1所述的式1所示的化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述式I所示的化合物在游离状态下显示最大发射波长为550-680nm，且在与硫醇结合状态下显示最大的发射波长为430-550nm。


7.如权利要求6所述的式1所示的化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述发射波长处的荧光强度在430nm至680nm的范围内升高或降低。


8.一种用于测量活细胞中抗氧化活性的组合物，其包含作为活性成分的如权利要求1至7中任一项的式I所示的化合物或其药学上可接受的盐。


9.如权利要求8所述的组合物，其特征在于，所述抗氧化活性测量是活细胞中硫醇水平的测量。


10.如权利要求9所述的组合物，其特征在于，所述硫醇水平的测量是细胞器中硫醇水平的测量。


11.如权利要求10所述的组合物，其特征在于，所述细胞细胞器为线粒体或高尔基体。


12.如权利要求11所述的组合物，其特征在于，所述线粒体中的抗氧化活性的测量是使用式III至V中的任一化合物进行的。


13.如权利要求11所述的组合物，其特征在于，所述高尔基体中的抗氧化活性的测量是使用式VII至IX中的任一化合物进行的。


14.如权利要求10所述的组合物，其特征在于，随着在硫醇水平的测量中硫醇水平的增加，在550-680nm处的荧光强度降低且在430-550nm处的荧光强度增加。


15.如权利要求14所...

【专利技术属性】
技术研发人员：姜欣濉，金慧美，宋知恩，金铭镇，崔基恒，
申请(专利权)人：塞尔吐温株式会社，
类型：发明
国别省市：韩国;KR