一种重组抗VEGFR2单克隆抗体的生物活性分析方法及其应用技术

本发明专利技术涉及一种重组抗VEGFR2单克隆抗体的生物活性分析方法及其应用，所述生物活性分析方法包括：将重组抗VEGFR2单克隆抗体与人脐静脉内皮细胞和VEGF试剂进行共培养，然后加入CCK8显色液继续培养，读取吸光值，根据重组抗VEGFR2单克隆抗体浓度与吸光值的量效关系进行4‑参数拟合，根据曲线拟合的EC

Bioactivity analysis of a recombinant anti VEGFR2 monoclonal antibody and its application

【技术实现步骤摘要】
一种重组抗VEGFR2单克隆抗体的生物活性分析方法及其应用
本专利技术属于生物分析
，具体涉及一种单克隆抗体的生物活性分析方法及其应用，尤其涉及一种重组抗VEGFR2单克隆抗体的生物活性分析方法及其应用。
技术介绍
VEGFR2在肿瘤相关的内皮细胞上高表达。当VEGF与肿瘤细胞相关内皮细胞上的VEGFR2结合后启动信号级联反应，引起内皮细胞增殖和转移，血管壁通透性增加，将导致血管生成，为肿瘤发生、发展提供足够的氧分和营养。抗VEGFR2重组全人化单克隆抗体能够特异性阻断血管内皮生长因子受体2(VEGFR-2)与其配体VEGF的相互作用，抑制VEGFR2的激活以及下游信号传导途径，阻断肿瘤血管的生成，从而阻断对肿瘤细胞的血液供应，抑制肿瘤细胞的增殖，进而导致肿瘤细胞凋亡。Cyramza是由美国礼来开发的全球首个靶向VEGFR2(血管内皮生长因子受体2)的全人源化单克隆抗体药物，通过抑制肿瘤血管生成达到抑制肿瘤的目的，于2014年在美国、日本和欧盟批准上市，是目前唯一一个无需筛选患者的治疗胃癌二线靶向药物，被推荐为胃癌二线首选药物，此外还可用于结直肠癌、非小细胞肺癌的治疗。重组抗VEGFR2单克隆抗体的应用价值巨大，对其的相关研究必然涉及到对其的生物学活性评价，目前还没有一种专门针对其的生物活性分析方法，因此，完成对重组抗VEGFR2单克隆抗体的生物学细胞活性方法开发是非常有意义的。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种单克隆抗体的生物活性分析方法及其应用，尤其提供一种重组抗VEGFR2单克隆抗体的生物活性分析方法及其应用。为达到此专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案：一方面，本专利技术提供一种重组抗VEGFR2单克隆抗体的生物活性分析方法，所述生物活性分析方法包括：将重组抗VEGFR2单克隆抗体与人脐静脉内皮细胞和VEGF试剂进行共培养，然后加入CCK8显色液继续培养，读取吸光值，根据重组抗VEGFR2单克隆抗体浓度与吸光值的量效关系进行4-参数拟合，根据曲线拟合的EC50值进行生物活性评价。本专利技术所涉及的生物活性分析方法是一种专门针对于重组抗VEGFR2单克隆抗体的生物活性分析方法，该方法灵敏度高、准确度高，且适用范围广，对不同效价水平的重组抗VEGFR2单克隆抗体均能进行检测，对重组抗VEGFR2单克隆抗体的中间体、原液或成品的生物活性均能进行检测。优选地，所述进行共培养时，人脐静脉内皮细胞的活细胞密度为0.5×105-1×105细胞/mL，例如0.5×105细胞/mL、0.55×105细胞/mL、0.6×105细胞/mL、0.65×105细胞/mL、0.7×105细胞/mL、0.75×105细胞/mL、0.8×105细胞/mL、0.85×105细胞/mL或1×105细胞/mL等，范围内的其他具有点值均可选择，在此便不一一赘述。优选0.5×105细胞/mL。所述进行共培养时，人脐静脉内皮细胞的活细胞密度特定选择在0.5×105-1×105细胞/mL范围内，因为不同的细胞铺板密度对4-参数拟合曲线的信号值及拟合情况会造成影响，细胞密度不够或者太多都有可能造成信号值偏低，药物敏感性下降；若超过此浓度，拟合曲线的上下平台的区间变小，可能由于细胞过多不利于充分与药物相互作用，导致对药物作用敏感性下降所致。优选地，所述进行共培养时，VEGF试剂的浓度为0.2-2μg/mL，例如0.2μg/mL、0.5μg/mL、0.8μg/mL、1μg/mL、1.2μg/mL、1.5μg/mL或2μg/mL等，范围内的其他具体点值均可选择，在此便不一一赘述。优选0.5μg/mL。所述进行共培养时，VEGF试剂的浓度特定选择为0.2-2μg/mL范围内，因为不同的VEGF浓度对4-参数拟合曲线的信号值及拟合情况会造成影响，VEGF浓度不够或者太多都有可能造成信号值偏低，药物敏感性下降；再升高浓度，信号值基本不变，上下平台的区间也基本稳定。优选地，所述共培养的时间为60-70h，例如60h、61h、62h、65h、66h、67h、68h或70h等，范围内的其他具体点值均可选择，在此便不一一赘述。所述共培养的时间特定选择在60-70h范围内，是因为增殖抑制信号的区间需要足够长的时间才能表现出来，超过此时间范围会浪费时间，增加检测工作的时间成本，小于此时间范围会使得增殖抑制信号的区间较小，不利于方法的精密度和准确度。优选地，所述共培养的温度为35-39℃，例如35℃、36℃、37℃、38℃或39℃等，范围内的其他具体点值均可选择，在此便不一一赘述。优选地，所述加入CCK8显色液继续培养的时间为3.5-4h，例如3.5h、3.6h、3.7h、3.8h、3.9h或4h等，范围内的其他具体点值均可选择，在此便不一一赘述。所述加入CCK8显色液继续培养的时间特定选择为3.5-4h，是因为显色时间较短则不足以检测到足够的增殖抑制信号区间，若超过此时间范围会浪费时间，增加检测工作的时间成本，若小于此时间范围会使得增殖抑制信号的区间较小，不利于方法的精密度和准确度。优选地，所述加入CCK8显色液继续培养的温度为35-39℃，例如35℃、36℃、37℃、38℃或39℃等，范围内的其他具体点值均可选择，在此便不一一赘述。优选地，所述读取吸光值是使用酶标仪读取，检测波长450nm，参比波长620nm。作为本专利技术的优选技术方案，所述重组抗VEGFR2单克隆抗体的生物活性分析方法具体包括如下步骤：(1)将对数生长期的人脐静脉内皮细胞进行消化并制成单细胞悬液，用ECM完全培养基调整其活细胞密度，于35-39℃下培养5-7h，弃上清，换用0.1％FBS的ECM培养基继续培养12-18h；(2)向步骤(1)孵育后的细胞中分别加入不同浓度的重组抗VEGFR2单克隆抗体溶液，于35-39℃下培养1.5-2.5h；(3)向步骤(2)处理后的样品中加入VEGF试剂，于35-39℃下培养60-70h；(4)向步骤(3)处理后的样品中加入CCK8显色液继续培养3.5-4h，用酶标仪读取吸光值，检测波长450nm，参比波长620nm，根据重组抗VEGFR2单克隆抗体浓度与吸光值的量效关系进行4-参数拟合，根据曲线拟合的EC50值进行生物活性评价。上述步骤(1)示例性地可以具体为：取对数生长期的人脐静脉内皮细胞，按照细胞传代培养流程进行细胞消化，用ECM完全培养基将经过消化的细胞洗脱下来离心，接着用ECM完全培养基将细胞重悬制成人脐静脉内皮单细胞悬液，混匀，进行细胞计数，确定活细胞数及细胞活率。接着用ECM完全培养基调整活细胞密度至0.5×105细胞/mL，以100μL/孔加入96孔细胞培养板中。将96孔细胞培养板置于恒温培养箱中培养。弃掉上清，以100μL/孔加入0.1％FBS的ECM分析培养基，周边以PBS封边，于恒温培养箱中培养过夜。上述步骤(2)中不同浓度的重组抗VEGFR2单克隆抗体溶液是指重组抗VEGFR本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组抗VEGFR2单克隆抗体的生物活性分析方法，其特征在于，所述生物活性分析方法包括：将重组抗VEGFR2单克隆抗体与人脐静脉内皮细胞和VEGF试剂进行共培养，然后加入CCK8显色液继续培养，读取吸光值，根据重组抗VEGFR2单克隆抗体浓度与吸光值的量效关系进行4-参数拟合，根据曲线拟合的EC

【技术特征摘要】
1.一种重组抗VEGFR2单克隆抗体的生物活性分析方法，其特征在于，所述生物活性分析方法包括：将重组抗VEGFR2单克隆抗体与人脐静脉内皮细胞和VEGF试剂进行共培养，然后加入CCK8显色液继续培养，读取吸光值，根据重组抗VEGFR2单克隆抗体浓度与吸光值的量效关系进行4-参数拟合，根据曲线拟合的EC50值进行生物活性评价。


2.如权利要求1所述的重组抗VEGFR2单克隆抗体的生物活性分析方法，其特征在于，所述进行共培养时，人脐静脉内皮细胞的活细胞密度为0.5×105-1×105细胞/mL；优选0.5×105细胞/mL。


3.如权利要求1或2所述的重组抗VEGFR2单克隆抗体的生物活性分析方法，其特征在于，所述进行共培养时，VEGF试剂的浓度为0.2-2μg/mL；优选0.5μg/mL。


4.如权利要求1-3中任一项所述的重组抗VEGFR2单克隆抗体的生物活性分析方法，其特征在于，所述共培养的时间为60-70h。


5.如权利要求1-4中任一项所述的重组抗VEGFR2单克隆抗体的生物活性分析方法，其特征在于，所述共培养的温度为35-39℃。


6.如权利要求1-5中任一项所述的重组抗VEGFR2单克隆抗体的生物活性分析方法，其特征在于，所述加入CCK8显色液继续培养的时间为3.5-4h。


7.如权利要求1-6中任一项所述的重组抗VEGF...

【专利技术属性】
技术研发人员：王少雄，吕品，
申请(专利权)人：上海博威生物医药有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31