一种利用空斑染色测定异嗜性鼠白血病病毒滴度的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用空斑染色测定异嗜性鼠白血病病毒（X‑MuLV）滴度的方法，本发明专利技术以猫星形脑胶质细胞(PG4细胞)作为检测X‑MuLV的指示细胞，用空斑测定法(plaque assay)准确定量测定X‑MuLV病毒的滴度。包括如下步骤：将病毒稀释；在6孔板中的每个孔内加入细胞生长液；将不同稀释度的病毒加入细胞孔中，转移入细胞培养箱中孵育；加入培养基‑琼脂混合物培养5至6天；终止培养，染色，读取病毒空斑数；计算病毒滴度。本发明专利技术能够克服传统空斑测定法操作上耗时费力，并且使用的指示细胞是不常用的细胞株，不易获得等缺点，且具有灵敏度强、背景清晰、稳定性好，可重复性强等优点。

A method for the determination of heterophilic mouse leukemia virus titer by plaque staining

【技术实现步骤摘要】
一种利用空斑染色测定异嗜性鼠白血病病毒滴度的方法
本专利技术属于生物医药
，具体涉及一种可以应用于病毒清除研究的异嗜性鼠白血病病毒(Xenotropicmurineleukemiavirus,X-MuLV)滴度的测定方法。
技术介绍
近年来，单克隆抗体（mAb）和其他重组蛋白（RPs）等生物制品已成为生物医药产业中非常重要的一类产品。现代生物制品常以动物细胞作为蛋白表达系统，以保证蛋白产物正确的构象和生物活性。其中最为常用的细胞系为中国仓鼠卵巢细胞系（CHO细胞），CHO细胞或可能含有内源性逆转录病毒或可能在培养过程中污染外源性病毒[参见:1.BartalAH,FeitC,ErlandsonR,HirshautY.1982.Thepresenceofviralparticlesinhybridomaclonessecretingmonoclonalantibodies.NEnglJMed306:1423；2.GarnickRL.1998.Rawmaterialsasasourceofcontaminationinlargescalecellculture.DevBiolStand93:21–29.]。因此各国药监机构要求这类制品在临床实验前和生产阶段前申报材料中纯化工艺必须经过病毒清除/灭活验证，以确保不会出现病毒污染，保证患者的用药安全。病毒清除/灭活验证通过添加指示病毒来评估纯化工艺各个步骤的清除能力，其中异嗜性鼠白血病病毒(Xenotropicmurineleukemiavirus,X-MuLV)是常用的指示病毒之一。X-MuLV是一种具有包膜的逆转录病毒，基因组为单链RNA，病毒大小80–130nm，是CHO细胞常见的内源性病毒，通常作为鼠源细胞逆转录病毒的模型病毒。对于X-MuLV病毒的定量测定，有通过提取检测样品的RNA，利用反转录荧光定量PCR（RT-qPCR）法通过检测X-MuLV的特异性基因来定量测定病毒的含量[参见：3.闻洁。一种异嗜性小鼠白血病病毒的特异性引物及检测方法，CN201810720390.8，2018.09.14；4.JohnM.Irving,LucilleW.S.Chang,FranciscoJ.Castillo.Areversetranscriptase-polymerasechainreactionassayforthedetectionandquantitationofmurineretroviruses.Naturebiotechnology.1993,11:1042-1046；5.MikovitsJudyA,LombardiVincent,RuscetteSandra,Ruscettifrancis,SilvermanRobert.Detectionofxenotropicmurineleukemiavirus,US:81889310:A,2011.06.23.]。但该类方法主要是通过对病毒基因组中保守基因的扩增来测定病毒的含量，因为这种方法检测的是病毒的基因，其检测结果并不能反映病毒的感染活性。空斑法是一种经典的病毒定量方法，利用空斑法测定X-MuLV病毒或者是和它同家族的其他MuLV病毒的文献均发表于40年前，相关方法描述较为简单，所使用的细胞也不是常用的细胞系，因此不具备较高的应用价值[参见：6.BjórnAndersen.Aplaqueassayformurineleukemiavirususingenzyme-coupledantibodies.Virology.1977,77(2):849-852；7.PeterJ.Fischinger,CharlotteS.Blevins,ShigekoNomura.Simple,QuantitativeAssayforBothXenotropicMurineLeukemiaandEcotropicFelineLeukemiaViruses.Journalofvirology.1974,14(1):177-179；8.MichikoKoga.TitrationofmurineleukemiaviruseswithratcelllineRFL.Journalofvirology.1977,23(2):436-438。]。通过对中英文专利的检索，也没发现明确地应用空斑检测法测定X-MuLV滴度的专利。因此急需开发出一种有效的测定X-MuLV病毒滴度的方法，使之适用于病毒清除验证研究。病毒清除验证是要验证客户生物制品纯化工艺中清除有感染活力的病毒的能力，因此病毒清除验证中需要一种能够准确测定活病毒的量的方法，这样才能准确的评价各个纯化步骤对病毒清除/灭活的效果。本专利技术即利用空斑染色准确测定有感染活力的X-MuLV病毒，适用于病毒清除验证的需要。针对X-MuLV病毒的准确定量多采用空斑计数法测定病毒的滴度，传统的空斑测定法(plaqueassay)多报道于四十年前，有的测定思路是利用酶联免疫法通过抗原抗体反应间接检测病毒来测定病毒的滴度，有的方法为了克服MuLV病毒无法在细胞上增值，通过M-MSV转化的猫细胞系或者寻找不常见的大鼠成纤维细胞来进行病毒滴度测定，受制于方法上的缺陷，这些方法操作上耗时费力，并且使用的指示细胞也是不常用的细胞株，不易获得，因此需要寻找新的常用细胞系用于X-MuLV病毒的测定，同时还需满足以下要求：X-MuLV应对新的指示细胞具有高度敏感性，能够在引起明显的细胞病变效应，并且能够在指示细胞上产生易于观察的病毒空斑；测定时间段；在一定的病毒滴度范围内，病毒的滴度应与产生的空斑数目应呈良好的线性关系；测定结果应具有稳定性，不同时间、不同细胞批次、不同的操作者均不会影响实验结果，可重复性要好，检测灵敏度要高；该方法的各种参数，包括：线性标准曲线、线性相关系数、测定范围、检测限、精密度、灵敏度等方面，都符合相关法规要求。
技术实现思路
本专利技术克服了传统空斑测定法操作上耗时费力，并且使用的指示细胞也是不常用的细胞株，不易获得的技术缺陷，提供了一种以猫星形脑胶质细胞作为检测X-MuLV的指示细胞，用空斑测定法定量测定X-MuLV病毒的滴度的方法。为解决上述技术问题，本专利技术采用如下技术方案：本专利技术提供一种利用空斑染色测定异嗜性鼠白血病病毒滴度的方法，该方法以猫星形脑胶质细胞作为检测异嗜性鼠白血病病毒X-MuLV的指示细胞，用空斑测定法定量测定X-MuLV病毒的滴度。作为本专利技术优选的技术方案，该方法包括如下步骤：（I）.将PG4细胞接种于细胞培养六孔板中，至细胞汇合度为30%，用稀释液对X-MuLV病毒进行稀释，用不同稀释度的X-MuLV病毒去感染PG4细胞，吸去细胞培养基；（II）.将接种病毒的细胞转移入细胞培养箱中进行孵育，再弃去病毒液，在每个细胞孔中加入培养基-琼脂混合物，培养基-琼脂混合物完全凝固后将细胞培养板转移至细胞培养箱中，培养5至6天；（III）.细胞出现明显的空斑后终止培养，去除细胞表面的固体琼脂，加入染色液对细胞进行染色，染色5分钟后本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用空斑染色测定异嗜性鼠白血病病毒滴度的方法，其特征在于：该方法以猫星形脑胶质细胞PG4细胞作为检测异嗜性鼠白血病病毒X-MuLV的指示细胞，用空斑测定法定量测定X-MuLV病毒的滴度。/n

【技术特征摘要】
1.一种利用空斑染色测定异嗜性鼠白血病病毒滴度的方法，其特征在于：该方法以猫星形脑胶质细胞PG4细胞作为检测异嗜性鼠白血病病毒X-MuLV的指示细胞，用空斑测定法定量测定X-MuLV病毒的滴度。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
（I）.将PG4细胞接种于细胞培养六孔板中，至细胞汇合度为30%，用稀释液对X-MuLV病毒进行稀释，用不同稀释度的X-MuLV病毒去感染PG4细胞，吸去细胞培养基；
（II）.将接种病毒的细胞转移入细胞培养箱中进行孵育，再弃去病毒液，在每个细胞孔中加入固体培养基，固体培养基完全凝固后将细胞培养板转移至细胞培养箱中，培养5至6天；
（III）.细胞出现明显的空斑后终止培养，去除细胞表面的固体琼脂，加入染色液对细胞进行染色，染色5分钟后，洗净细胞，晾干细胞培养六孔板，并读取每孔的病毒空斑数目，根据空斑数目结合稀释倍数计算X-MuLV病毒的滴度。


3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（I）中，每个细胞孔接种1×105~1.5×105个细胞，亦可调整接种细胞的数目使病毒接种时孔内细胞汇合度达到30%。


4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（I）中，对病毒的稀释根据实际情况作2-10倍进行系列稀释。

【专利技术属性】
技术研发人员：秦冲，王丽，刘亚亚，邱忆涛，王毅，游思佳，罗薇，陈源源，汪景长，童涌，
申请(专利权)人：苏州药明检测检验有限责任公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32