一种用于H1N1亚型流感病毒遗传进化谱系鉴别的方法技术

本发明专利技术涉及一种用于H1N1亚型流感病毒遗传进化谱系鉴别的方法，属于流感病毒鉴别技术领域，其特征在于：包括针对H1N1亚型流感病毒4个遗传进化谱系鉴别引物的设计与筛选，荧光定量PCR鉴别质粒标准品的制备，以及荧光定量PCR方法的建立等步骤。在所建立的荧光定量PCR鉴别方法中，本发明专利技术利用4对鉴别引物，以不同拷贝数标准品的对数值为横坐标，以检测到的每个拷贝数所对应的Ct值为纵坐标，构建荧光定量PCR的标准曲线，同时检测待鉴定H1N1亚型流感病毒cDNA的Ct值是否处于标准曲线上，从而达到快速鉴别H1N1亚型流感病毒4个遗传进化谱系的目的，以此为H1N1亚型流感病毒的检验检疫、流行病学监测、优势流行谱系的筛查、疫苗种毒的选择等方面提供技术支撑。其简便快速、特异性强、敏感性高。

A method for identification of Genetic Evolution Pedigree of H1N1 influenza virus

【技术实现步骤摘要】
一种用于H1N1亚型流感病毒遗传进化谱系鉴别的方法
本专利技术涉及一种用于H1N1亚型流感病毒遗传进化谱系鉴别的方法，属于流感病毒鉴别

技术介绍
基于核蛋白和基质蛋白的抗原性差异，目前已经发现甲（A）型、乙（B）型、丙（C）型和丁（D）型等4个血清型的流感病毒，其中以A型流感病毒的流行史最为悠久、波及范围最广、传播能力最强、宿主感染谱最宽、引发的公共卫生威胁最为严重。根据A型流感病毒表面两个纤突蛋白—血凝素（hemagglutinin，HA）蛋白和神经氨酸酶（neuraminidase，NA）蛋白的抗原性差异，进一步将A型流感病毒分为不同的血清亚型，迄今已经发现了18种HA亚型和11种NA亚型。其中，H1N1亚型流感病毒在流感流行史上扮演了重要角色，其不仅可以导致人类的季节性和大流行性流感，而且也是引发哺乳动物流感和禽流感的重要病毒亚型。A型流感病毒编码的HA基因既是病毒抗原性的决定性蛋白，也是划分病毒遗传进化谱系的主要依据。对于H1N1亚型流感病毒而言，其HA基因已经演化出4个不同的遗传进化谱系，分别是古典猪流感病毒谱系（包括人类大流行性流感病毒）、季节性人流感病毒谱系、禽流感病毒谱系和欧亚类禽猪流感病毒谱系。查明H1N1亚型流感病毒的遗传进化谱系，有利于我们判断病毒的来源，明确各谱系病毒在人群和各动物群体中的感染和流行状况，分析各个群体中流行的优势流行谱系，选择与流行谱系抗原性相匹配的疫苗，以及筛选疫苗种毒等。目前流感病毒的鉴别方法主要包括血清学方法和分子生物学方法。由于A型流感病毒各血清亚型之间存在一定的交叉反应，因此血清学方法不是流感病毒血清亚型鉴别的首选方法。而分子生物学方法，如PCR技术已经广泛应用于临床呼吸道标本、粪便标本和组织脏器标本等样品中流感病毒的检测。在各种PCR方法中，荧光定量PCR方法是美国AppliedBiosystems公司于1996年推出的一种实验技术。该方法利用荧光染料或荧光标记的特异性核酸探针，可以对PCR反应中每一个循环扩增产物的荧光信号进行实时收集，从而实现对起始模板的定性和/或定量分析。由于荧光定量PCR方法具有操作简便、特异性强、敏感性高、准确快速等特点，已经成为流感病毒血清型和血清亚型鉴别的首选方法。荧光定量PCR方法包括绝对定量和相对定量。其中，绝对荧光定量是应用标准曲线来确定标本的实际拷贝数。其优点在于，可以测定目的基因在样本中的绝对分子数量。构建标准曲线是绝对荧光定量PCR的关键步骤。常用于构建标准曲线的方法是先将目的基因片段克隆到载体中以构建标准质粒，然后测定所构建标准质粒的浓度以计算其拷贝数，再以系列10倍倍比稀释的不同拷贝数的质粒作为模板进行荧光定量PCR，测定不同拷贝数质粒标准品的Ct值。以不同拷贝数标准品的对数值为横坐标，以检测到的每个拷贝数所对应的Ct值为纵坐标，构建荧光定量PCR的标准曲线。待鉴定流感毒株的cDNA在进行荧光定量PCR后，根据其Ct值在标准曲线上出现的位置可以计算出样品的浓度。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种用于H1N1亚型流感病毒遗传进化谱系鉴别的方法，是利用荧光定量PCR方法，实现了对H1N1亚型流感病毒遗传进化谱系进行鉴别的目的，是一种快速、特异、敏感的荧光定量PCR方法，用于鉴别H1N1亚型流感病毒的遗传进化谱系。本专利技术的技术方案是这样实现的：一种用于H1N1亚型流感病毒遗传进化谱系鉴别的方法，其特征在于包括如下步骤：（1）H1N1亚型流感病毒遗传进化谱系鉴别引物的设计针对NCBI与GISAID网站中所注册的H1N1亚型流感病毒HA基因的核苷酸序列，利用MEGA7.0软件，采用最大似然法，运算1000次，制作遗传进化树，划分出H1N1亚型流感病毒的4个遗传进化谱系，即古典猪流感病毒谱系、季节性人流感病毒谱系、禽流感病毒谱系、欧亚类禽猪流感病毒谱系。针对某一遗传进化谱系，至少设计1对PCR鉴别引物。每条引物设计的原则是：引物所处区域分别位于某一遗传进化谱系HA基因核苷酸序列的相对保守区，且该区域的核苷酸序列与其他遗传进化谱系HA基因的核苷酸序列存在明显差异，同时保证绝大多数差异位点位于所设计引物的3’端，以降低非特异性PCR扩增出现的概率。最终筛选出可以用于遗传进化谱系鉴别，只具有谱系内特异性，而无谱系间交叉反应的4对PCR鉴别引物。各谱系鉴别引物的序列信息如附表1所示。（2）H1N1亚型流感病毒遗传进化谱系鉴别荧光定量PCR方法标准品的构建根据H1N1亚型流感病毒HA基因遗传进化树的分析结果，从4个遗传进化谱系中各选取一株病毒的HA全长基因序列，其GenBank注册号分别为：MK159413、V01088、CY077076、KM028031（序列信息见附表2），送至南京金斯瑞生物科技有限公司进行基因合成，并与pEASY-T1Simple载体连接。将古典猪流感病毒谱系、季节性人流感病毒谱系、禽流感病毒谱系、欧亚类禽猪流感病毒谱系等4个谱系HA基因的重组质粒分别命名为pEASY-T1-I、pEASY-T1-II、pEASY-T1-III、pEASY-T1-IV，作为荧光定量PCR的标准品。（3）H1N1亚型流感病毒遗传进化谱系鉴别荧光定量PCR方法的建立①反应体系：在荧光定量PCR八联管中依次加入FastStartUniversalSYBRGreenMaster（ROX）10μL，ddH2O8.75μL，浓度为10μM的上/下游引物各0.5μL，待鉴定毒株的cDNA或5个不同拷贝数的标准品0.25μL，至终体积20μL。②反应条件：将配制好的反应体系置于荧光定量PCR仪上进行反应。第一阶段，95℃，2min；第二阶段，95℃，15s；47℃，30s；40个循环。③标准曲线构建：测定各遗传进化谱系所对应的标准品的质粒浓度，根据质粒浓度与拷贝数换算公式：拷贝数（copies/μL）=[质粒浓度（ng/μL）×6.02×1014]÷[660×（载体长度bp+目的片段长度bp）]，计算质粒的拷贝数。将质粒进行10倍倍比稀释，选择5个不同拷贝数（1010copies/μL、108copies/μL、106copies/μL、104copies/μL、102copies/μL）的标准品为模板，通过荧光定量PCR，以不同拷贝数标准品的对数值为横坐标，以检测到的每个拷贝数所对应的Ct值为纵坐标，构建荧光定量PCR的标准曲线。不同拷贝数标准品测得的Ct值呈现良好的线性关系，标准曲线相关系数R2≥0.90，且5个不同拷贝数质粒所对应的Ct值≤35。④结果判定标准：a.阳性结果：当待鉴定毒株cDNA的Ct值≤35，Ct值位于4条标准曲线中的其中一条，且出现扩增曲线和峰型单一的熔解曲线，则可以判定该毒株属于扩增该毒株所用鉴别引物对应的遗传进化谱系；b.阴性结果：阴性结果检测不到Ct值，且无扩增曲线和熔解曲线生成。本专利技术的积极效果是具有特异性强、敏感性高、检测时间短，不需要凝胶电泳和基因测序等实验内容，只需本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于H1N1亚型流感病毒遗传进化谱系鉴别的方法，其特征在于具体如下步骤：/n（1）针对H1N1亚型流感病毒的4个遗传进化谱系，即古典猪流感病毒谱系、季节性人流感病毒谱系、禽流感病毒谱系、欧亚类禽猪流感病毒谱系，分别筛选出可以用于遗传进化谱系鉴别、只具有H1N1亚型流感病毒遗传进化谱系内特异性，而无谱系间交叉反应的4对PCR鉴别引物；各谱系鉴别引物的序列信息；/n（2）根据H1N1亚型流感病毒HA基因遗传进化树的分析结果，从4个遗传进化谱系中各选取一株病毒的HA全长基因序列，其GenBank注册号分别为：MK159413、V01088、CY077076、KM028031，送至南京金斯瑞生物科技有限公司进行基因合成，并与pEASY-T1 Simple载体连接；将4个遗传进化谱系HA基因的重组质粒分别命名为pEASY-T1-I、pEASY-T1-II、pEASY-T1-III、pEASY-T1-IV，以此作为荧光定量PCR方法的标准品；/n（3）荧光定量PCR方法包括如下步骤：/n①荧光定量PCR方法的反应体系：/n在荧光定量PCR八联管中依次加入FastStart Universal SYBR Green Master（ROX）10μL，ddH...

【技术特征摘要】
1.一种用于H1N1亚型流感病毒遗传进化谱系鉴别的方法，其特征在于具体如下步骤：
（1）针对H1N1亚型流感病毒的4个遗传进化谱系，即古典猪流感病毒谱系、季节性人流感病毒谱系、禽流感病毒谱系、欧亚类禽猪流感病毒谱系，分别筛选出可以用于遗传进化谱系鉴别、只具有H1N1亚型流感病毒遗传进化谱系内特异性，而无谱系间交叉反应的4对PCR鉴别引物；各谱系鉴别引物的序列信息；
（2）根据H1N1亚型流感病毒HA基因遗传进化树的分析结果，从4个遗传进化谱系中各选取一株病毒的HA全长基因序列，其GenBank注册号分别为：MK159413、V01088、CY077076、KM028031，送至南京金斯瑞生物科技有限公司进行基因合成，并与pEASY-T1Simple载体连接；将4个遗传进化谱系HA基因的重组质粒分别命名为pEASY-T1-I、pEASY-T1-II、pEASY-T1-III、pEASY-T1-IV，以此作为荧光定量PCR方法的标准品；
（3）荧光定量PCR方法包括如下步骤：
①荧光定量PCR方法的反应体系：
在荧光定量PCR八联管中依次加入FastStartUniversalSYBRGreenMaster（ROX）10μL，ddH2O8.75μL，浓度为10μM的上/下游引物各0.5μL，待鉴定毒株的cDNA0.25μL，至终体积20μL；
②荧光定量PCR方法的反应条件：
将步骤（3）①的反应体系置于荧光定量PCR仪中进行反应，反应条件：第一阶段，95℃，2min；第二阶段，95℃，15s；47℃，30s；40个循环；
③荧光定量PCR标准曲线的构建：
将步骤（2）中所构建的标准品稀释成5个不同的拷贝数，分别为1010copies/μL、108copies/μL、106copies/μL、104copies/μL、102copies/μL；将步骤3①反应体系中的“待鉴定毒株的cDNA”分别替换为5个不同拷贝数的标准品...

【专利技术属性】
技术研发人员：丛彦龙，孙艺学，连晓欢，张鹏举，邓效禹，丁雪梅，凌蒙蒙，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：吉林;22