一种用于辅助诊断RA的试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术提供了一种用于辅助诊断RA的试剂盒及检测方法。该技术方案首先研究发现，不同活动期间RA患者外周血单个核细胞中的ATG5、ATG12基因的mRNA相对表达水平呈不同程度的表达差异，同时，ATG5、ATG12、Atg12‑Atg5蛋白含量也表现出相应的规律性，由此可确认，ATG5、ATG12基因表达变化或其相关蛋白含量的变化对RA的预后及活动具有一定的相关性和指向性。基于以上有益的发现，本发明专利技术开发了一种基于自噬性基因检测的RA辅助诊断试剂盒，该试剂盒以人的血清、血浆或其它体液作为生物检材，采用竞争抑制ELISA法定量测定其中ATG5、ATG12、Atg12‑Atg5偶联蛋白含量，可以此为依据来实现RA的辅助检查，并评价RA的病理特征和发展进程。

A kit and detection method for RA diagnosis

【技术实现步骤摘要】
一种用于辅助诊断RA的试剂盒及检测方法
本专利技术涉及疾病诊断试剂盒
，进一步涉及基于基因检测的疾病辅助诊断技术，具体涉及一种用于辅助诊断RA的试剂盒及检测方法。
技术介绍
类风湿关节炎(RA)是一种病因未明的慢性、以炎性滑膜炎为主的系统性疾病。RA关节炎的病理主要有滑膜衬里细胞增生、间质大量炎性细胞浸润，以及微血管的新生、血管翳的形成及软骨和骨组织的破坏等。症状多表现为手、足小关节的多关节、对称性、侵袭性关节炎症，经常伴有关节外器官受累及血清类风湿因子阳性，可以导致关节畸形及功能丧失。RA的发病可能与遗传、感染、性激素等有关，诊断标准包括以下一系列特征：1)晨僵≥30分钟；2)大于3个关节区的关节炎；3)手关节炎；4)类风湿因子(RF)阳性；5)抗CCP抗体阳性。14个关节区包括：双侧肘、腕、掌指、近端指间、膝、踝和跖趾关节；以上特征满足3条以上可诊断为RA。近年来，随着分子生物学和医学影像学的发展，其他检测依据被引入了RA的诊断中，例如，RA患者自身抗体的检出，是RA有别于其他炎性关节炎，如银屑病关节炎、反应性关节炎和骨关节炎的标志之一，目前临床常用的自身抗体包括类风湿因子(RF-IgM)、抗环状瓜氨酸(CCP)抗体、类风湿因子IgG及IgA、抗核周因子、抗角蛋白抗体，以及抗核抗体、抗ENA抗体等，同时，还包括抗RA33抗体、抗葡萄糖-6-磷酸异构酶(GPI)抗体，抗P68抗体等。此外，通过X射线可见软组织肿胀、骨质疏松及病情进展后的关节面囊性变、侵袭性骨破坏、关节面模糊、关节间隙狭窄、关节融合及脱位。MRI检查手关节及腕关节的MRI检查可提示早期的滑膜炎病变，对发现类风湿关节炎患者的早期关节破坏很有帮助，超声关节超声是简易的无创性检查，对于滑膜炎、关节积液以及关节破坏有鉴别意义。目前RA缺乏直接、有效的预防和治疗策略，缺乏高敏感性、特异性的诊断指标。临床上关节滑膜组织虽可通过手术或者穿刺留取，由于取材的有创性,使其应用受到一定限制。有研究表明，在RA的发病过程中，伴随着基因表达的改变，在这种情况下，如果能确切获得基因表达情况与RA病理特征间的关系，则有望成为RA诊断的新依据，基于基因表达情况的RA诊断方法，在稳定性和准确性方面更加可靠，然而，由于相关研究的缺失，目前尚不掌握对RA具有确切指向性的基因类别，也不清楚其表达水平与RA病理特征之间的关系。自噬作用是依赖溶酶体途径对胞质蛋白和细胞器进行降解的一种过程，细胞自噬通过特异性的识别底物并进行降解，维持细胞内环境稳态平衡，与许多疾病的发生发展密切相关。类风湿关节炎(RA)作为一种全身性、系统性的自身免疫病，自噬异常也可能与病理过程具有相关性，然而，目前这种相关性尚不明确；而且，自噬相关的蛋白质多达30多种，不同的自噬相关蛋白质还可相互结合形成核心Atg蛋白质复合物，其参与人体生理过程的机制非常复杂，现有技术中，这种相关性研究尚未取得理想的成果。
技术实现思路
本专利技术旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种用于辅助诊断RA的试剂盒及检测方法，以解决现有技术中，缺乏一种基于基因检测手段的、RA辅助诊断试剂盒的技术问题。本专利技术要解决的另一技术问题是，RA的病理进程与患者自噬性基因表达情况间的关系尚不明确。为实现以上技术目的，本专利技术采用以下技术方案：一种用于辅助诊断RA的试剂盒，包括：分别包被有ATG5抗原、ATG12抗原、Atg12-Atg5偶联蛋白抗原的孔板；阳性质控：ATG5阳性血清，ATG12阳性血清，Atg12-Atg5偶联蛋白阳性血清；阴性质控：健康人阴性血清；工作液R：标记有HRP的抗人ATG5抗体，标记有HRP的抗人ATG12抗体，标记有HRP的抗人Atg12-Atg5偶联蛋白抗体；稀释液：去离子水；TMB底物；终止液：1mol/L的H2SO4溶液；浓缩清洗洗涤液：PBS-Tween缓冲液。作为优选，所述孔板为96孔板。作为优选，所述ATG5阳性血清，ATG12阳性血清，Atg12-Atg5偶联蛋白阳性血清各为50μL。作为优选，所述健康人阴性血清为50μL。作为优选，所述标记有HRP的抗人ATG5抗体，标记有HRP的抗人ATG12抗体，标记有HRP的抗人Atg12-Atg5偶联蛋白抗体各为150μL。作为优选，所述去离子水的体积为工作液R总体积的100倍。作为优选，所述TMB底物有15份，每份为100μL。作为优选，所述终止液有15份，每份为50μL。作为优选，所述浓缩清洗洗涤液有20份，每份为250μL。一种应用上述试剂盒检测类风湿关节炎的方法，包括以下步骤：1)加样：将孔板上的孔划分为标准孔，待测样品孔，空白孔，其中所述标准孔有3孔，向3个标准孔中分别加入3种阳性质控，每种阳性质控各50μL，空白孔加50μL阴性质控，待测样品孔中加入待测样品50μL；每孔加工作液R150μL，振动混匀，孔板加覆膜，于37℃温育1小时；2)弃去孔内液体，每孔用250μL的浓缩清洗洗涤液洗涤，浸泡1分钟，而后清除孔内所有液体；重复洗板3次，最后一次洗涤后，倒出剩余的浓缩清洗洗涤液，将酶标板倒扣在吸水纸上，将残留在孔内的液体全部吸干；3)每孔加TMB底物100μL，酶标板加上覆膜，于37℃避光显色10～30min；4)每孔加终止液50μL，终止反应。本试剂盒应用竞争抑制酶联免疫分析法测定样本中ATG5、ATG12、Atg12-Atg5偶联蛋白复合物的含量。将单克隆抗体包被微孔板，制成固相载体，往包被抗体的微孔中同时加入生物素标记的抗原和待测抗原(标准品或样本)，待测抗原与生物素标记抗原对特异性抗体进行竞争结合。温育后经洗涤去掉未结合物，然后加入HRP标记的亲和素，经过温育和彻底洗涤后加入底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。待测标本浓度越高，标记抗原和抗体的结合就越受到抑制，显色愈浅。显色的深浅与酶量呈正相关，而与样品中待测物质含量呈负相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值)，计算样品浓度。本专利技术提供了一种用于辅助诊断RA的试剂盒及检测方法。该技术方案首先研究了RA患者基因表达情况与病理特征之间的关系，研究发现，不同活动期间RA患者外周血单个核细胞中的ATG5、ATG12基因的mRNA相对表达水平呈不同程度的表达差异，同时，ATG5、ATG12、Atg12-Atg5蛋白含量也表现出相应的规律性，由此可确认，ATG5、ATG12基因表达变化或其相关蛋白含量的变化对RA的预后及活动具有一定的相关性和指向性。基于以上有益的发现，本专利技术开发了一种基于自噬性基因检测的RA辅助诊断试剂盒，该试剂盒以人的血清、血浆或其它体液作为生物检材，采用竞争抑制ELISA法定量测定其中ATG5、ATG12、Atg12-Atg5偶联蛋白含量，可以此为依据来实现RA的辅助检查，并评价RA的病理特征和发展进程。本专利技术简便易行，检测过程对人体创伤较小，评价依据更为稳定可靠。附图本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于辅助诊断RA的试剂盒，其特征在于包括：/n分别包被有ATG5抗原、ATG12抗原、Atg12-Atg5偶联蛋白抗原的孔板；/n阳性质控：ATG5阳性血清，ATG12阳性血清，Atg12-Atg5偶联蛋白阳性血清；/n阴性质控：健康人阴性血清；/n工作液R：标记有HRP的抗人ATG5抗体，标记有HRP的抗人ATG12抗体，标记有HRP的抗人Atg12-Atg5偶联蛋白抗体；/n稀释液：去离子水；/nTMB底物；/n终止液：1mol/L的H

【技术特征摘要】
1.一种用于辅助诊断RA的试剂盒，其特征在于包括：
分别包被有ATG5抗原、ATG12抗原、Atg12-Atg5偶联蛋白抗原的孔板；
阳性质控：ATG5阳性血清，ATG12阳性血清，Atg12-Atg5偶联蛋白阳性血清；
阴性质控：健康人阴性血清；
工作液R：标记有HRP的抗人ATG5抗体，标记有HRP的抗人ATG12抗体，标记有HRP的抗人Atg12-Atg5偶联蛋白抗体；
稀释液：去离子水；
TMB底物；
终止液：1mol/L的H2SO4溶液；
浓缩清洗洗涤液：PBS-Tween缓冲液。


2.根据权利要求1所述的一种用于辅助诊断RA的试剂盒，其特征在于所述孔板为96孔板。


3.根据权利要求1所述的一种用于辅助诊断RA的试剂盒，其特征在于所述ATG5阳性血清，ATG12阳性血清，Atg12-Atg5偶联蛋白阳性血清各为50μL。


4.根据权利要求1所述的一种用于辅助诊断RA的试剂盒，其特征在于所述健康人阴性血清为50μL。


5.根据权利要求1所述的一种用于辅助诊断RA的试剂盒，其特征在于所述标记有HRP的抗人ATG5抗体，标记有HRP的抗人ATG12抗体，标记有HRP的抗人Atg12-Atg5偶联蛋白抗体各为150μL。


6.根据权...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭月丽，
申请(专利权)人：漳州卫生职业学院，
类型：发明
国别省市：福建;35