用于蛋白质免疫印迹封闭的蛋白粉制备与封闭方法技术

本发明专利技术是一种用于蛋白质免疫印迹中封闭转印膜的鱼明胶蛋白粉的制备方法，该方法用PBS缓冲液溶解海鱼鱼皮明胶制成鱼皮明胶溶液，用牛胰蛋白酶和凝血酶冻干粉混合酶溶液酶解，超滤，富集，干燥得到鱼明胶蛋白。本发明专利技术还公开了蛋白质免疫印迹封闭方法。本发明专利技术有效解决了在蛋白质免疫印迹实验中转印膜的封闭效果不佳、曝光的背景高、非特异性条带检出等常见的问题。采用本发明专利技术中用于蛋白质免疫印迹实验的封闭剂，抗体孵育后经ECL底物检测可以得到特异性蛋白检出带且背景干净无杂带，同时也缩短孵育时间至15min，为获得准确、高效的实验结果提供技术基础。

Preparation and sealing method of protein powder for Western blotting

【技术实现步骤摘要】
用于蛋白质免疫印迹封闭的蛋白粉制备与封闭方法
本专利技术属于蛋白质研究
，具体涉及一种用于蛋白质免疫印迹中封闭转印膜的鱼明胶蛋白粉的制备方法；本专利技术还公开了一种蛋白质免疫印迹封闭方法。
技术介绍
蛋白质免疫印迹（WesternBlot）技术是将蛋白质样品经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，利用抗原抗体反应来检测目的蛋白的方法。它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。常规的WesternBlot的操作流程包括：蛋白样品的制备、电泳分离、转膜、封闭、洗涤、一抗孵育、洗涤、二抗孵育、洗涤、检测。然而该方法涉及步骤、因素较多，因此为得到较好的实验结果，常见的影响因素有：蛋白样品的准确定量、蛋白凝胶的制备、转印条件、电泳的条件设置、缓冲液的选择、封闭液的选择和封闭条件、抗体的特异性、化学发光显色液等。对转印膜的充分封闭是获得准确的蛋白测定的关键因素。目前实验室常用的封闭缓冲液有：5%脱脂奶粉、5%BSA等来自于哺乳动物牛源的蛋白成分。而在WesternBlot实验中使用的抗体主要本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于蛋白质免疫印迹中封闭转印膜的鱼明胶蛋白粉的制备方法，其特征在于，其步骤如下：/n（1）用PBS缓冲液溶解海鱼鱼皮明胶，配制成质量浓度为10%-50%的鱼皮明胶溶液；/n（2）将牛胰蛋白酶、凝血酶冻干粉，按重量比为1:10至10:1的配比，用灭菌纯化水配制成1mg/mL的混合酶溶液，备用；/n（3）将配制好的鱼明胶溶液恒温至37℃，50-100rpm搅拌；/n（4）缓慢加入适量配制好的混合酶溶液，37℃保温反应6h；/n（5）升温至60℃，保温30min，使酶失活，结束酶解反应；/n（6）用两级超滤膜系统处理反应液，一级膜使小分子蛋白透过，为水解的明胶与适活的酶富集后处理；蛋白经二级...

【技术特征摘要】
1.一种用于蛋白质免疫印迹中封闭转印膜的鱼明胶蛋白粉的制备方法，其特征在于，其步骤如下：
（1）用PBS缓冲液溶解海鱼鱼皮明胶，配制成质量浓度为10%-50%的鱼皮明胶溶液；
（2）将牛胰蛋白酶、凝血酶冻干粉，按重量比为1:10至10:1的配比，用灭菌纯化水配制成1mg/mL的混合酶溶液，备用；
（3）将配制好的鱼明胶溶液恒温至37℃，50-100rpm搅拌；
（4）缓慢加入适量配制好的混合酶溶液，37℃保温反应6h；
（5）升温至60℃，保温30min，使酶失活，结束酶解反应；
（6）用两级超滤膜系统处理反应液，一级膜使小分子蛋白透过，为水解的明胶与适活的酶富集后处理；蛋白经二级膜浓缩，富集至蛋白浓度为50%；
（7）喷雾干燥，得到鱼明胶蛋白。


2.根据权利要求1所述的用于蛋白质免疫印迹中封闭转印膜的鱼明胶蛋白粉的制备方法，其特征在于，步骤（1）中：鱼皮明胶溶液的质量浓度为15%-25%。


3.根据权利要求1所述的用于蛋白质免疫印迹中封闭转印膜的鱼明胶蛋白粉的制备方法，其特征在于，步骤（2）中：将牛胰蛋白酶、凝血酶冻干粉，按重量比为2-5:1的比例配成混合酶溶液。


4.一种蛋白质免疫印迹封闭方法，其特征在于，该方法使用权利要求1或2或3所制得的鱼明胶蛋白粉作封闭液原料，其具体步骤如下：
（1）蛋白样本的提取：取新鲜培养的A549细胞，去除培养液，用PBS洗涤细胞；按照6孔板每孔加入200μlRIPA细胞裂解液，含终浓度为1mMPMSF，用枪吹打数下，使裂解液和细胞充分接触并裂解细胞；裂解后的细胞样本置于14,000g下离心5min，取上清液分装到PCR管中，置于-80℃备用；
（2）蛋白定量和上样前处理：取步骤（1）制备的蛋白提取物采用BCA法测定蛋白浓度；向已测定的蛋白浓度的样本中加入质量体积比5倍的蛋白上样缓冲液，充分混匀置于95℃金属浴中变性10min，瞬离置于-80℃备用；
（3）凝胶制备：根据蛋白的分子量大小，配制10%的SDS-PAGE分离胶和5%的SDS-PAGE浓缩胶，在加入TEMED后立即灌胶；
（4）灌胶：将干净的玻璃板固定好，然后加入预先配制好的分离胶，并加无水乙醇封除去气泡；待胶凝固后，用滤纸吸干玻璃板中无水乙醇，然后加入浓缩胶并插入梳子，待胶再次凝固后轻轻拔出梳子；
（5）电泳：取步骤（4）制备的SDS-聚丙烯酰胺凝胶，放置于电泳槽中，同时向电泳槽中加入TGS电泳缓冲液，取步骤（2）制备的浓度为2.4mg/mL的A549细胞裂解液上样10µL并开始电泳；浓缩胶电压为80V，分离胶电压为130V，待条带到达玻璃板底部时结束电泳；
（6）转膜：将（5）完成电泳后的分离胶用于转膜；PVDF膜于甲醇中活化3min，将夹子的黑色面放入装有转移液的玻璃平皿中，从下到上依次放入一层海绵垫，三层滤纸，分离胶，PVDF膜，三层滤纸，最后盖上一层海绵垫，排掉气泡，夹紧夹子，加入预冷的转膜缓冲液，设定电流为200mA，于冰浴中转膜100min；
（7）封闭：将步骤（6）转好的PVDF膜裁膜处理成4张，按照以下封闭液和封闭条件进行封闭，10%鱼明胶蛋白粉封闭液，室温封闭15min；5%脱脂乳，室温封闭1h；

【专利技术属性】
技术研发人员：葛绍勇，赵盼盼，刘杨，陈志强，夏加权，姜林先，
申请(专利权)人：莫纳连云港生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32