一种成熟脂肪细胞特异性β-catenin敲除小鼠的构建方法技术

本发明专利技术涉及一种成熟脂肪细胞特异性β‑catenin敲除小鼠的构建方法。本发明专利技术证实了β‑catenin能够抑制Saa3的转录表达，揭示了经典Wnt信号通路如何影响成熟脂肪细胞的功能进而影响肥胖发生，或为肥胖治疗提供新的思路。

Construction of mature adipocyte specific \u03b2 - Catenin knockout mice

【技术实现步骤摘要】
一种成熟脂肪细胞特异性β-catenin敲除小鼠的构建方法
本专利技术属于肥胖治疗领域，特别涉及一种成熟脂肪细胞特异性β-catenin敲除小鼠的构建方法。
技术介绍
众多研究已经证实，Wnt信号通路是调节脂肪组织发育的一个关键通路。OrmondA.MacDougald在2000年公布一项研究，发现在3T3-L1细胞中过表达WNT1或激活型β-catenin能够抑制脂肪细胞生成，利用药物抑制GSK3β也能够阻断脂肪细胞的分化。更进一步的结果发现，Wnt信号通路激活可通过阻止PPARγ和CEBP/α的诱导表达，从而发挥对脂肪细胞分化的抑制作用。相反，通过过表达组成型(constitutiveactitive)AXIN或者持续失活型(dominantnegative)TCF7L2会导致脂肪前体细胞的自发性分化。需要注意的是，上述干预都发生在脂肪诱导分化的极早期；而Wnt通路在成熟细胞中的生理功能未被涉及。然而，Wnt信号通路核心分子β-catenin体内水平如何调节脂肪功能仍不清楚。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种成熟脂肪细胞特异性β-catenin敲除小鼠的构建方法，该方法证实了β-catenin能够抑制Saa3的转录表达，揭示了经典Wnt信号通路如何影响成熟脂肪细胞的功能进而影响肥胖发生，或为肥胖治疗提供新的思路。本专利技术提供了一种成熟脂肪细胞特异性β-catenin敲除小鼠的构建方法，包括：将C57BL/6背景的β-cateninflox/flox小鼠与Adiponectin-Cre小鼠交配，获得Adiponectin-Cre；β-cateninflox/wt小鼠之后，与β-cateninflox/flox小鼠交配，后代中获得对照小鼠β-cateninflox/flox和敲除小鼠Adiponectin-Cre；β-cateninflox/flox，即成熟脂肪细胞特异性β-catenin敲除小鼠，记作ABKO敲除小鼠。所述小鼠均饲养在SPF级屏障环境中。所述环境温度为20-22℃。有益效果本专利技术证实了β-catenin能够抑制Saa3的转录表达，揭示了经典Wnt信号通路如何影响成熟脂肪细胞的功能进而影响肥胖发生，或为肥胖治疗提供新的思路。附图说明图1A为aP2-cre；β-cateninflox/flox脂肪细胞条件敲除小鼠构建模式图。图1B为对照小鼠和APBKO小鼠3周和8周龄体重。图1C为8周龄对照小鼠和APBKO小鼠代表性大体照。图1D为adiponectin-cre；β-cateninflox/flox脂肪细胞条件敲除小鼠构建模式图。图1E-G为对比皮下脂肪组织、内脏脂肪组织和棕色脂肪组织中，β-catenin在成熟脂肪细胞和SVF细胞中的表达水平。图1H-I为对照小鼠和ABKO小鼠在正常饮食和高脂饮食喂养情况下的体重曲线。图1J为24周龄高脂喂养的对照小鼠和ABKO小鼠的代表性大体照片。图1K为高脂饮食喂养对照小鼠和ABKO小鼠的fatmass和leanmass。图2A为高脂饮食喂养的对照和ABKO小鼠在16小时饥饿后进行葡萄糖耐量实验。图2B为葡萄糖耐量实验的曲线下面积统计结果。图2C为高脂饮食喂养的对照和ABKO小鼠在6小时饥饿后进行胰岛素耐量实验。图2D为胰岛素耐量实验的曲线下面积统计结果。图2E为高脂饮食喂养的对照和ABKO小鼠血浆空腹胰岛素水平。图2F左图为高脂饮食喂养的对照和ABKO小鼠皮下脂肪组织的磷酸化Akt和总Akt蛋白质印迹检测结果；右图为磷酸化Akt和总Akt灰度统计结果。图2G-H为高脂饮食喂养的对照和ABKO小鼠血浆甘油三酯和总胆固醇水平。图2I为高脂饮食喂养的对照和ABKO小鼠肝脏HE染色代表性图片，比例尺为100μm。图2J为高脂饮食喂养的对照和ABKO小鼠肝脏甘油三酯定量结果。图2K为高脂饮食喂养的对照和ABKO小鼠皮下脂肪组织中巨噬细胞标志物F4/80、CD68和CD11c的mRNA表达水平。图2L左图为高脂饮食喂养的对照和ABKO小鼠皮下脂肪中巨噬细胞的流式分析代表性图片；右图为流式分析统计结果。图2M为高脂饮食喂养的对照和ABKO小鼠皮下脂肪组织中M1型巨噬细胞标志物的mRNA表达水平。图2N-P为高脂饮食喂养的对照和ABKO小鼠血浆Leptin、Resistin和PAI-1水平。图3A为对照小鼠和ABKO小鼠棕色脂肪组织、皮下脂肪组织和内脏脂肪组织的代表性照片。图3B-C为高脂饮食喂养的对照小鼠和ABKO小鼠的脂肪组织绝对重量和组织/体重百分比。图3D为高脂饮食喂养的对照小鼠和ABKO小鼠皮下脂肪组织的HE染色代表性图片。图3E左图为高脂饮食喂养对照小鼠和ABKO小鼠皮下脂肪组织脂肪细胞直径的分布频率；右图为两组小鼠皮下脂肪组织脂肪细胞直径的箱型图。图3F为高脂饮食喂养对照小鼠和ABKO小鼠皮下脂肪组织HE染色图片单个视野下的脂肪细胞数目。图3G左图为高脂饮食喂养对照小鼠和ABKO小鼠的皮下脂肪组织流式分析PDGFRα+细胞比例结果代表性图片；右图为PDGFRα+细胞在对照小鼠和ABKO小鼠皮下脂肪SVF细胞中的比例统计。图3H左图为对照小鼠和ABKO小鼠皮下脂肪组织PDGFRα和BrdU染色代表性图片；右图为对照小鼠和ABKO小鼠皮下脂肪组织中，PDGFRα+BrdU+细胞在PDGFRα细胞中的比例统计。图4A为高脂饮食喂养的对照小鼠和ABKO小鼠皮下脂肪组织基因表达谱，热图显示两组差异表达基因，倍数变化大于1.5，对应P值小于0.05。图4B为QPCR验证两组小鼠皮下脂肪组织中Saa3表达。图4C为QPCR检测敲低β-catenin后诱导分化的3T3-L1细胞中Saa3表达。图4D为Wnt3a处理诱导分化的3T3-L1细胞16小时，检测Saa3表达。图4E为Wnt信号通路抑制剂PKF115处理诱导分化的SVF细胞48小时，检测Saa3表达。图4F左图为SAA3启动子区域潜在TCF4结合位点模式图；右图为在3T3-L1细胞系中转染报告基因质粒，48小时后报告基因检测结果。pRL-TK(表达海肾荧光素酶)用作内参。图4G为在3T3-L1细胞中用TCF-4抗体进行染色质免疫共沉淀，通过PCR检测SAA3启动子DNA片段。图4H为在3T3-L1细胞中用β-catenin抗体进行染色质免疫共沉淀，通过PCR检测Saa3启动子DNA片段。图4I为Saa3重组蛋白刺激Raw264.7细胞，用上清处理3T3-L1细胞实验设计模式图。图4J-L为不同浓度Saa3重组蛋白刺激Raw264.7细胞后，上清中PDGF-AA、Mcp-1和Cxcl2的浓度。图4M为不同浓度Saa3重组蛋白刺激Raw264.7细胞获得的上清进一步处理3T3本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种成熟脂肪细胞特异性β-catenin敲除小鼠的构建方法，包括：/n将C57BL/6背景的β-catenin

【技术特征摘要】
1.一种成熟脂肪细胞特异性β-catenin敲除小鼠的构建方法，包括：
将C57BL/6背景的β-cateninflox/flox小鼠与Adiponectin-Cre小鼠交配，获得Adiponectin-Cre；β-cateninflox/wt小鼠之后，与β-cateninflox/flox小鼠交配，后代中获得对照小鼠β-cateninflox/fl...

【专利技术属性】
技术研发人员：宁光，王计秋，芦鹏，刘瑞欣，
申请(专利权)人：上海交通大学医学院附属瑞金医院，上海市内分泌代谢病研究所，
类型：发明
国别省市：上海;31