一种构建人源化鼠肿瘤模型及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种人源化鼠肿瘤模型，其特征在于，所述人源化鼠肿瘤模型是通过移植人胸腺组织和与所述胸腺组织同源的CD34+造血干细胞获得。本发明专利技术首次构建由胸腺和造血干细胞移植的人源化鼠肿瘤模型。该人源化鼠肿瘤模型确定了其具有完整的免疫抑制微环境，并适用做实体瘤免疫治疗的总体评估，可应用于评价免疫治疗疗效的可行性和有效性。本发明专利技术弥补了现有肿瘤免疫治疗评价方法的单一性和模型不完整性，为临床研究提供了参考价值，与传统模型相比，补充了人免疫系统在免疫疗法的关键作用。

A kind of human tumor model of mouse and its preparation and Application

【技术实现步骤摘要】
一种构建人源化鼠肿瘤模型及其制备方法和应用
本专利技术属于生物医学
，具体涉及一种人源化鼠肿瘤模型及其制备方法和应用。
技术介绍
肿瘤是指机体在各种致瘤因子作用下，局部组织细胞增生所形成的新生物，特别是在恶性肿瘤中，其生长迅速，侵袭能力强，易发生转移，治疗后容易复发，能使患者生活质量及生命健康明显下降。尽管目前有很多医疗手段用于肿瘤治疗，如手术，化疗，放疗等，但尚无一个有效的手段能够彻底根治肿瘤。近年来，肿瘤免疫疗法取得巨大进展，其中以人工嵌合抗原受体T细胞(chimericantigenreceptorTcells,CAR-Tcells)技术和免疫检查点抑制剂为主要手段，肿瘤免疫治疗在基础研发阶段取得大量的成就，然而在临床应用仍有待发展。CAR-T细胞技术是指将人工设计的通过识别肿瘤抗原即可激活T细胞的表面受体通过转基因技术导入T细胞，T细胞通过识别肿瘤抗原对肿瘤细胞进行特异性杀伤的技术。目前CAR-T细胞在治疗血液性肿瘤效果良好，但也具有细胞因子风暴，神经毒性等副作用，另一方面，CAR-T治疗在临床实体瘤治疗中响应强度较弱，这与实体瘤低氧，酸性，高抑制性的免疫微环境有关。免疫检查点是指免疫细胞中抑制性的信号通路，是免疫激活的刹车系统，其中包括PDL1/PD1,CTLA4,TIM3,LAG3,TIGIT,BALT,FASL/FAS等，针对这些相应配体或者受体为靶点开发的单克隆抗体来封闭抑制性通路从而逆转T细胞的耗竭状态，重新激活T细胞，即是免疫检查点抑制剂技术，免疫检查点同样存在响应强度不高，副反应严重等缺点。新型的肿瘤免疫治疗研究的瓶颈问题在于缺乏一个有效的临床前肿瘤模型来评价其安全性和有效性。肿瘤免疫微环境与免疫系统密切相关，在之前的研发中，免疫缺陷鼠和天然小鼠被广泛应用于肿瘤模型的构建，由于免疫缺陷鼠不存在免疫系统，其微环境不完整，不适用于免疫学相关研究；而天然小鼠具有免疫系统却存在种属差异，阻碍其向临床转化。免疫系统人源化鼠可以建立免疫细胞与肿瘤细胞的相互作用，目前，已有相关文章报道通过移植外周血单核细胞(PBMC)来构建免疫系统人源化鼠肿瘤模型，但是这种模型免疫细胞种类有限，存活时间短，抗宿主疾病(GVHD)发生频率较高；造血干细胞小鼠模型可以重建多种免疫细胞，但T细胞没有经过胸腺驯化，其功能不完整，因此该模型免疫系统功能不完整，极易造成GVHD。有研究表明，通过移植人胸腺组织和造血干细胞，T细胞可以经过胸腺组织阴性选择和阳性选择发育成成熟具有功能的T细胞，并且有利于其他免疫细胞的分化成熟，GVHD发生几率大大减小。目前尚无报道胸腺和造血干细胞移植的人源化鼠实体瘤模型在肿瘤免疫治疗中的应用。
技术实现思路
本专利技术目的在于克服现有肿瘤模型的不足，提供一个具有完整免疫抑制微环境的人源化鼠肿瘤模型，该肿瘤模型能评估免疫疗法临床前的安全性和有效性。本专利技术还提供了性人源化鼠模型的构建方法以及免疫系统人源化鼠肿瘤模型与传统免疫缺陷鼠肿瘤模型的肿瘤微环境评价指标，通过比较确定传统免疫缺陷鼠肿瘤模型免疫微环境不完整，对免疫响应能力较强，未能如实模拟临床疾病模型，进一步确定了人源化鼠肿瘤模型免疫微环境能模拟临床病人对免疫治疗的响应能力，通过人源化鼠肿瘤模型模拟肿瘤微环境对免疫治疗的抑制效应。为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为：一种人源化鼠肿瘤模型，所述人源化鼠肿瘤模型是通过移植人胸腺组织和同源的CD34+造血干细胞获得。该人源化鼠肿瘤模型具有完整的人免疫系统。本专利技术还提供一种人源化鼠肿瘤模型的制备方法，包括以下步骤：(1)构建免疫系统人源化鼠：对重度免疫缺陷小鼠以亚致死剂量X射线进行辐照，并移植人胸腺组织以及同源胎肝CD34+造血干细胞；(2)检测步骤(1)构建的小鼠的外周血、外周免疫器官和中枢免疫器官中的免疫细胞；(3)将人永生化肿瘤细胞系或病人来源的肿瘤组织植入步骤(1)的免疫系统人源化鼠，获得人源化鼠肿瘤模型。进一步地，所述人源化鼠肿瘤模型的制备方法，还包括检测所述步骤(3)人源化鼠肿瘤模型的免疫微环境评价指标；进一步地，所述人源化鼠肿瘤模型的制备方法，还包括使用CAR-T细胞治疗方法来评价人源化鼠肿瘤模型的免疫响应程度。进一步地，所述CAR-T细胞治疗方法通过下方法实现：首先构建抗原表达肿瘤细胞和对应CAR-T细胞；然后检测CAR-T在人源化鼠肿瘤模型中的响应程度。进一步地，所述构建抗原表达肿瘤细胞通过下方法实现：首先利用转基因技术将表达人源CD19基因载体导入肿瘤细胞中，通过嘌呤霉素筛选获得表达CD19单克隆肿瘤细胞，其中人源CD19基因包含序列SEQIDNO:1所示；然后利用慢病毒载体构建CAR-T细胞，CAR基因编码的人工嵌合蛋白序列如SEQIDNO:2所示。进一步地，所述检测CAR-T在人源化鼠肿瘤模型中的响应程度通过下方法实现：检测CAR-T细胞对人源化鼠肿瘤模型的抑制能力、T细胞浸润能力、肿瘤清除能力以及T细胞的状态。本专利技术还提供了如上所述的人源化鼠肿瘤模型在免疫治疗评价方法或系统中的应用。本专利技术的有益效果：传统免疫缺陷鼠肿瘤模型不具备完整免疫抑制微环境，不能模拟临床实体瘤对免疫治疗的响应。由此本专利技术首次构建由胸腺和造血干细胞移植的人源化鼠肿瘤模型。并经试验检测由此开发的人源化鼠肿瘤模型确定了其具有完整的免疫抑制微环境，并适用做实体瘤免疫治疗的总体评估，重点在于其应用于评价免疫治疗疗效的可行性和有效性。本专利技术弥补了现有肿瘤免疫治疗评价方法的单一性和模型不完整性，为临床研究提供了参考价值，与传统模型相比，补充了人免疫系统在免疫疗法的关键作用。本专利技术基于人源化鼠，具有可操作性，对肿瘤免疫疗法评价进行创新和补充，并考虑了免疫系统对免疫治疗的影响，该专利技术保持了模型临床疾病可接近性，实现了科研效益和经济效益。附图说明图1为人源化鼠重建的人免疫细胞检测结果示意图(由图1可以看出，人免疫细胞如T细胞(CD3阳性细胞)，B细胞(CD19阳性细胞)，NK细胞(CD56阳性细胞)，单核细胞(CD14阳性细胞)，树突状细胞(CD11c阳性细胞)能够在小鼠外周和免疫器官中检测得到，说明移植胸腺和造血干细胞可以有效在免疫缺陷鼠中重建人的免疫系统)。图2为人源化鼠和免疫缺陷鼠形成的肿瘤效果示意图(由图2可以看出，永生化肿瘤细胞在免疫缺陷鼠和人源化鼠中均可有效形成肿瘤)。图3为人源化鼠和免疫缺陷鼠肿瘤环境抑制性分子表达谱图(由图3可以看出，与传统的免疫缺陷鼠形成的肿瘤模型相比，人源化鼠肿瘤具备更为强烈的免疫微环境)。图4为人源化鼠肿瘤，外周血，脾脏的调节性T细胞流式图(由图4可以看出，人源化鼠肿瘤中，大量富集调节性T细胞)。图5为人源化鼠肿瘤T细胞基因表达图谱(由图5可以看出，在肿瘤微环境中，激活性T细胞表达量明显下降，抑制性T细胞相关基因表达量明显升高，表明在肿瘤微环境中，T细胞呈现一种耗竭的状态)。图6为人CD19基因表达载体示意图。...

【技术保护点】
1.一种人源化鼠肿瘤模型，其特征在于，所述人源化鼠肿瘤模型是通过移植人胸腺组织和与所述胸腺组织同源的CD34+造血干细胞获得。/n

【技术特征摘要】
1.一种人源化鼠肿瘤模型，其特征在于，所述人源化鼠肿瘤模型是通过移植人胸腺组织和与所述胸腺组织同源的CD34+造血干细胞获得。


2.一种人源化鼠肿瘤模型的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)构建免疫系统人源化鼠：对重度免疫缺陷小鼠以亚致死剂量X射线进行辐照，并移植人胸腺组织以及同源肝CD34+造血干细胞；
(2)检测步骤(1)构建的小鼠的外周血、外周免疫器官和中枢免疫器官中的免疫细胞；
(3)将人永生化肿瘤细胞系或病人来源的肿瘤组织植入步骤(1)的免疫系统人源化鼠，获得人源化鼠肿瘤模型。


3.如权利要求2所述的人源化鼠肿瘤模型的制备方法，其特征在于，还包括检测所述步骤(3)人源化鼠肿瘤模型的免疫微环境评价指标。


4.如权利要求3所述的人源化鼠肿瘤模型的制备方法，其特征在于，所述人源化鼠肿瘤模型的制备方法，还包括使用CAR-T细胞治疗方法来评价人源化鼠肿瘤模型的免疫响应程度。


5.如权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐洋，陈渠，付雪梅，
申请(专利权)人：中山大学附属第八医院深圳福田，南方医科大学，
类型：发明
国别省市：广东;44