一种检测结核分枝杆菌核酸的样本处理试剂、试剂盒及结核分枝杆菌的核酸扩增方法技术

本发明专利技术提供了一种检测结核分枝杆菌核酸的样本处理试剂、试剂盒及结核分枝杆菌的核酸扩增方法，所述样本处理试剂包括消化液、Tris‑HCl溶液和裂解液；所述消化液为含有以下浓度组分的水溶液：二硫苏糖醇13‑14g/L；氯化钠100‑105g/L；氯化钾2‑3g/L；磷酸氢二钠14‑15.5g/L；磷酸二氢钾2‑3g/L；所述裂解液为含有以下浓度组分的水溶液：NaOH 0.08‑0.15w/v％；SDS 0.02‑0.03w/v％。所述检测结核分枝杆菌核酸的样本处理试剂可以更快捷更有效地从痰液样本中提取结核分枝杆菌DNA，有效去除人源DNA的干扰，且在处理过程中完全灭活了结核分枝杆菌，有效的降低了人员感染的风险，更加安全高效。所述检测结核分枝杆菌核酸的试剂盒具有很好的灵敏度、特异性和准确性，可以实现结核分枝杆菌核酸的快速检测。

A sample processing reagent, kit and nucleic acid amplification method for detection of Mycobacterium tuberculosis nucleic acid

【技术实现步骤摘要】
一种检测结核分枝杆菌核酸的样本处理试剂、试剂盒及结核分枝杆菌的核酸扩增方法
本专利技术属于核酸检测
，具体涉及一种检测结核分枝杆菌核酸的样本处理试剂、试剂盒及结核分枝杆菌的核酸扩增方法。
技术介绍
结核病(TB)是由结核分枝杆菌(MTBC)引起的，几十年来一直是一个全球性的公共卫生挑战。据估计，2016年全球新增结核病病例1040万例，死亡人数170万人。传统的结核病诊断从根本上依赖于抗酸杆菌(AFB)涂片显微镜和选择固体培养基上的分枝杆菌培养，但这些方法都存在局限性。首先，AFB涂片的敏感性低(30-40％)，其准确性往往受到限制。其次，虽然以培养为基础的方法具有很高的准确性，长期以来一直被认为是实验室结核病诊断的金标准，但分枝杆菌培养的周转时间长(3-8周)往往导致诊断延迟。商业上可获得的实时聚合酶链反应(PCR)检测方法，如Abbott实时MTB检测法和GeneXpertMTB/RIFUltra可提供及时和准确的结核病诊断。然而，这些商业检测仍然过于昂贵，特别对于大多数结核病负担较高发展中国家而言无法常规使用。
技术实现思路
基于此，本专利技术提供一种检测结核分枝杆菌核酸的样本处理试剂、试剂盒及结核分枝杆菌的核酸扩增方法。所述检测结核分枝杆菌核酸的样本处理试剂可以更快捷地从痰液样本中提取结核分枝杆菌及其DNA，有效去除人源DNA的干扰，且可以完全灭活结核分枝杆菌，更加安全高效。具体技术方案为：一种检测结核分枝杆菌核酸的样本处理试剂，所述处理试剂包括消化液、Tris-HCl溶液和裂解液；所述消化液为含有以下浓度组分的水溶液：二硫苏糖醇13-14g/L；氯化钠100-105g/L；氯化钾2-3g/L；磷酸氢二钠14-15.5g/L；磷酸二氢钾2-3g/L；所述Tris-HCl溶液的浓度为0.08-0.12mol/L；所述裂解液为含有以下浓度组分的水溶液：NaOH0.08-0.15w/v％；SDS0.02-0.03w/v％。在其中一些实施例中，所述消化液的pH值为7.2-7.6。在其中一些实施例中，优选所述消化液为含有以下浓度组分的水溶液：二硫苏糖醇13.33g/L；氯化钠104g/L；氯化钾2.67g/L；磷酸氢二钠14.93g/L；磷酸二氢钾2.67g/L。在其中一些实施例中，所述Tris-HCl溶液的浓度为0.1±0.01mol/L。在其中一些实施例中，优选所述裂解液为含有以下浓度组分的水溶液：NaOH0.1w/v％；SDS0.025w/v％。本专利技术还提供了一种检测结核分枝杆菌核酸的样本处理方法。具体技术方案为：一种检测结核分枝杆菌核酸的样本处理方法，包括以下步骤：(1)向痰液样本中加入上述消化液，震荡混匀，然后于60-70℃孵育10-15分钟；(2)将步骤(1)获得的混合液于13200g±50g离心8-15分钟，弃上清；(3)向步骤(2)获得的沉淀中加入上述Tris-HCl溶液，震荡混匀，然后于13200g±50g离心8-15分钟，弃上清；(4)向步骤(3)获得的沉淀中加入上述裂解液，然后于60-70℃孵育45-60分钟；(5)向步骤(4)获得的混合液中加入上述Tris-HCl溶液，混匀，得到DNA溶液。在其中一些实施例中，所述痰液样本、消化液和裂解液的体积比为1：(0.1-0.3)：(0.1-0.2)；优选地，所述痰液样本、消化液和裂解液的体积比为1：0.1：0.1，专利技术人在研究中发现，当所述痰液样本、消化液和裂解液的体积比为1：0.1：0.1时可取得更好的处理效果。在其中一些实施例中，所述步骤(1)中于65℃孵育10分钟。在其中一些实施例中，所述步骤(2)中于13200g离心10分钟；所述步骤(3)中于13200g离心10分钟。在其中一些实施例中，所述步骤(4)中于65℃孵育45分钟。所述检测结核分枝杆菌核酸的样本处理方法先通过温和的强还原剂消化液把粘稠的痰在短时间内液化，使细菌和人体细胞碎片分开，不需要把人体细胞全部溶解，因此不含人源DNA；进一步在痰液液化离心弃上清液后加入适合人体生理条件的pH值的Tris-Hcl溶液，可以再次去除样本中的剩余人体细胞及其他杂质；最后加入裂解液，将细菌的细胞壁溶解破坏打开细胞膜，释放DNA。本专利技术还提供了一种检测结核分枝杆菌核酸的试剂盒。具体技术方案为：一种检测结核分枝杆菌核酸的试剂盒，包含以下组分：上述检测结核分枝杆菌核酸的样本处理试剂；针对IS6110的引物对1；针对IS6110的引物对2；针对IS6110的探针引物；质控模板；针对质控模板的探针引物；所述针对IS6110的引物对1包括序列如SEQIDNO.1所示的IS6110-FW1和SEQIDNO.2所示的IS6110-RV1；针对IS6110的引物对2包括序列如SEQIDNO.3所示的IS6110-FW2和SEQIDNO.4所示的IS6110-RV2；针对IS6110的探针引物序列如SEQIDNO.5所示，探针引物的5’端修饰有荧光基团，3’端修饰有猝灭基团；所述质控模板含有小鼠RAB3A癌基因片段和IS6110引物对2结合区域；所述质控模板序列如SEQIDNO.6所示；针对质控模板的探针引物序列如SEQIDNO.7所示，探针引物的5’端修饰有荧光基团，3’端修饰有猝灭基团，且所述荧光基团和猝灭基团与针对IS6110的探针引物的荧光基团和猝灭基团不相同。在其中一些实施例中，所述针对IS6110的探针引物的5’端修饰有荧光基团FAM，3’端修饰有猝灭基团BHQ1；针对质控模板的探针引物的5’端修饰有荧光基团LC610，3’端修饰有猝灭基团BBQ。SEQIDNO.1：5’-CCGGCCAGCACGCTAATTAACGGTTC-3’SEQIDNO.2：5’-TGTGGCCGGATCAGCGATCGTGGT-3’SEQIDNO.3：5'-CTGCACACAGCTGACCGA-3'SEQIDNO.4：5’-CGTTCGACGGTGCATCTG-3’SEQIDNO.5：5'-FAM-ATGGCGAACTCAAGGAGCACATCAGC-BHQ1-3'SEQIDNO.6：5’-GGTACCTCGCGAATGCATCTAGATGACCCAATTCGAGTCGATCTGCACACAGCTGACCGATCAAGGTACTGGGCCTGTGAAGTTTTCGAACTAGAAAGAGAAATGGGTGGAAGAGGCTAAGCCTGGCTTCCCGGAGCAGGCACAACATGCCTGTATGGGAAGGTTGGTATAGGCAGAGTCGTGACAGTGGTGCGTGATCGCCCCTTAGAGGAACTGTGGCTGTCACTGCAGGCTGAGCTCAGATGCACCGTCGAACGGCTGATGACCAAAATTGGGATCGGATCCCGGGCCCGTCGACTGCAGAGG本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测结核分枝杆菌核酸的样本处理试剂，其特征在于，所述处理试剂包括消化液、Tris-HCl溶液和裂解液；所述消化液为含有以下浓度组分的水溶液：二硫苏糖醇13-14g/L；氯化钠100-105g/L；氯化钾2-3g/L；磷酸氢二钠14-15.5g/L；磷酸二氢钾2-3g/L；所述Tris-HCl溶液的浓度为0.08-0.12mol/L；所述裂解液为含有以下浓度组分的水溶液：NaOH 0.08-0.15w/v％；SDS 0.02-0.03w/v％。/n

【技术特征摘要】
1.一种检测结核分枝杆菌核酸的样本处理试剂，其特征在于，所述处理试剂包括消化液、Tris-HCl溶液和裂解液；所述消化液为含有以下浓度组分的水溶液：二硫苏糖醇13-14g/L；氯化钠100-105g/L；氯化钾2-3g/L；磷酸氢二钠14-15.5g/L；磷酸二氢钾2-3g/L；所述Tris-HCl溶液的浓度为0.08-0.12mol/L；所述裂解液为含有以下浓度组分的水溶液：NaOH0.08-0.15w/v％；SDS0.02-0.03w/v％。


2.根据权利要求1所述的检测结核分枝杆菌核酸的样本处理试剂，其特征在于，所述消化液为含有以下浓度组分的水溶液：二硫苏糖醇13.33g/L；氯化钠104g/L；氯化钾2.67g/L；磷酸氢二钠14.93g/L；磷酸二氢钾2.67g/L。


3.根据权利要求1所述的检测结核分枝杆菌核酸的样本处理试剂，其特征在于，所述Tris-HCl溶液的浓度为0.1±0.01mol/L。


4.根据权利要求1所述的检测结核分枝杆菌核酸的样本处理试剂，其特征在于，所述裂解液为含有以下浓度组分的水溶液：NaOH0.1w/v％；SDS0.025w/v％。


5.一种检测结核分枝杆菌核酸的样本处理方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)向痰液样本中加入权利要求1或2所述的消化液，震荡混匀，然后于60-70℃孵育10-15分钟；
(2)将步骤(1)获得的混合液于13200g±50g离心8-15分钟，弃上清；
(3)向步骤(2)获得的沉淀中加入权利要求1或3所述的Tris-HCl溶液，震荡混匀，然后于13200g±50g离心8-15分钟，弃上清；
(4)向步骤(3)获得的沉淀中加入权利要求1或4所述的裂解液，然后于60-70℃孵育45-60分钟；
(5)向步骤(4)获得的混合液中加入权利要求1或3所述的Tris-HCl溶液，混匀，得到DNA溶液。


6.根据权利要求5所述的检测结核分枝杆菌核酸的样本处理方法，其特征在于，所述痰液样本、消化液和裂解液的体积比为1：(0.1-0.3)：(0.1-0.2)；优选地，所述痰液样本、消化液和裂解液的体积比为1：0.1：0.1。


7.根据权利要求5所述的检测结核分枝杆菌核酸的样本处理方法，其特征在于，所述步骤(1)中于65℃孵育10分钟。


8.根据权利要求5所述的检测结核分枝杆菌核酸的样本处理方法，其特征在于，所述步骤(2)中于13200g离心10分钟；所述步骤(3)中于13200g离心10分钟。


9.根据权利要求5所述的检测结核分枝杆菌核酸的样本处理方法，其特征在于，所述步...

【专利技术属性】
技术研发人员：韩琦，陈敬贤，刘勇，严婷，于世辉，任永昌，马超杰，
申请(专利权)人：广州金域医学检验集团股份有限公司，广州金域医学检验中心有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44