猪链球菌、副猪嗜血杆菌和猪支气管败血波氏杆菌三重荧光PCR检测的引物、探针及方法技术

本发明专利技术提供了猪链球菌、副猪嗜血杆菌和猪支气管败血波氏杆菌三重荧光PCR检测的引物、探针及方法，引物和探针分别根据猪链球菌的gdh基因、副猪嗜血杆菌的16SrRNA基因和猪支气管败血波氏杆菌的fla基因设计并且合成，建立的引物、探针及方法可以对上述3种细菌同时进行定性及定量的检测，相比现有的检测技术，减少了检测时间及检测成本；本发明专利技术检测方法灵敏度高，能够特异性的识别猪链球菌、副猪嗜血杆菌和猪支气管败血波氏杆菌，对其他杂菌无反应，具有良好的特异性及重复性，该三重荧光PCR检测的检测时间短、准确度高、可靠性强，能实现实时监测，具有很高的可行性与应用前景。

Primers, probes and methods for triple fluorescent PCR detection of Streptococcus suis, Haemophilus parasuis and Bordetella bronchiseptica

【技术实现步骤摘要】
猪链球菌、副猪嗜血杆菌和猪支气管败血波氏杆菌三重荧光PCR检测的引物、探针及方法
本专利技术属于核酸检测领域，具体涉及猪链球菌、副猪嗜血杆菌和猪支气管败血波氏杆菌三重荧光PCR检测的引物、探针及方法。
技术介绍
呼吸道疾病一直是困扰我国养猪业的一大难题，其中猪链球菌、副猪嗜血杆菌、猪支气管败血波氏杆菌是目前猪群呼吸道疫病中主要的病原菌，且这三种病菌还往往是混合感染。混合感染会增加病原对机体的损伤，提高猪呼吸道疾病综合征的发病率和死亡率。猪链球菌引起的猪链球菌病是一种急性人畜共患传染病。它会引起败血症、关节炎、脑膜炎和心内膜炎，从而导致巨大的经济损失。猪链球菌有荚膜，为革兰氏阳性菌，常单独出现或成对出现，偶尔出现短链，猪链球菌在血平板培养后有明显的α或β溶血环。猪链球菌根据其荚膜多糖抗原性的差异分为35个血清型，其中2型（SS2）流行最广，致病力最强，是疫情监控和病原鉴定的首要检测对象。副猪嗜血杆菌是猪上呼吸道中的共生革兰氏阴性细菌病原体。它是格拉瑟氏病的病原体，一种以多关节炎，纤维蛋白性多浆膜炎和脑膜炎为特征的全身性疾病。副猪嗜血杆菌是仔猪高死亡率的主要致病因素，已经成为危害养猪业发展的关键细菌性传染病。除一部分分离菌株无法鉴定其血清型外，副猪嗜血杆菌血清型已被鉴定出有十五种，血清型不同，毒力也具有很大差异。从世界范围来看4、5、13型较为流行，国内以4型和5型较为流行。副猪嗜血杆菌常与猪的几种重要病原体并发感染，目前已发现其可以与猪流感病毒、猪呼吸与繁殖障碍综合征病毒以及圆环病毒引起混合感染。猪支气管败血波氏杆菌可引起猪发生非进行性萎缩性鼻炎和支气管炎，也是猪呼吸道综合征的重要致病因子之一。近年来随着中国集约化养猪业的发展及猪的引种、调动频繁，由猪支气管败血波氏杆菌引起的非进行性萎缩性鼻炎、猪呼吸道综合征等疾病也随之扩散蔓延，造成较大经济损失。猪支气管败血波氏杆菌和其它多种病原体，如多杀性巴氏杆菌、猪链球菌、副猪嗜血杆菌、绿脓杆菌、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪流感病毒、圆环病毒等有协同致病作用，这样的协同作用可提高呼吸道疾病的发病率并增加疾病的严重程度，造成严重损失。猪链球菌病、副猪嗜血杆菌病、猪支气管败血波氏杆菌病这几种疫病的临床症状相似，混合感染和继发感染更是给诊断带来困难。目前，对它们的检测方法多采用细菌分离鉴定、补体结合实验、间接血凝实验、ELISA和免疫组化等检测方法，存在灵敏度和准确度较低，耗时较长等问题。PCR方法也可用于上述3种病原体的检测，但是鉴于现有的PCR检测方法多为单荧光检测，无法实现单管内同时检测猪链球菌病、副猪嗜血杆菌病和猪支气管败血波氏杆菌，增加了检测及监测的工作量和成本。
技术实现思路
为解决上述问题，本专利技术提供猪链球菌、副猪嗜血杆菌和猪支气管败血波氏杆菌三重荧光PCR检测的引物、探针及方法，该检测方法灵敏度高，特异性强，具有较好重复性。为了实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为：猪链球菌、副猪嗜血杆菌和猪支气管败血波氏杆菌三重荧光PCR检测的引物和探针，其特征在于：引物的核苷酸序列为：猪链球菌上游引物Suis-gdhQF：5’-GTCATGGACTCGTGAAGAAGTAG-3’（SEQIDNO:1）；猪链球菌下游引物Suis-gdhQR：5’-GTAGTCTGTACCAAGGTCGTATTT-3’（SEQIDNO:2）；副猪嗜血杆菌上游引物HPSQF：5’-GCGTAGTATCGGGAGATGAAAG-3’（SEQIDNO:3）；副猪嗜血杆菌下游引物HPSQR：5’-TAGAGATCGTCGGCTTGGTAGG-3’（SEQIDNO:4）；猪支气管败血波氏杆菌上游引物BBQF：5’-GGCTTCTTCAAACCGGGCAGCT-3’（SEQIDNO:5）；猪支气管败血波氏杆菌下游引物BBQR：5’-GTCGCAAACCTGCCGTAATCCAG-3’（SEQIDNO:6）；探针的核苷酸序列为：猪链球菌特异探针Suis-gdhQP：5’-X1-TTGGCTGTGTTGAAGATGTTGGCC-Y1-3’（SEQIDNO:7）；副猪嗜血杆菌特异探针HPSQP：5’-X2-ACCGCAAGGCCAGTTGCCATAAGAT-Y2-3’（SEQIDNO:8）；猪支气管败血波氏杆菌的特异探针BBQP：5’-X3-CCGCCCATCTGTAACATCGGACTT-Y3-3’（SEQIDNO:9）。进一步的，探针序列5’端标记的荧光基团X1、X2和X3分别为FAM、HEX、CY5、JOE、ROX中的一种，且X1、X2、X3互不相同，探针序列3’端标记的淬灭基团Y1、Y2和Y3分别为BHQ1、BHQ2、BHQ3、TAMRA中的一种。进一步的，猪链球菌特异探针Suis-gdhQP：5’-FAM-TTGGCTGTGTTGAAGATGTTGGCC-BHQ2-3’；副猪嗜血杆菌特异探针HPSQP：5’-HEX-ACCGCAAGGCCAGTTGCCATAAGAT-BHQ1-3’；猪支气管败血波氏杆菌特异探针BBQP：5’-CY5-CCGCCCATCTGTAACATCGGACTT-BHQ2-3’。本专利技术还提供猪链球菌、副猪嗜血杆菌和猪支气管败血波氏杆菌三重荧光PCR检测的方法，其特征在于：具体步骤为：步骤一、计算猪链球菌、副猪嗜血杆菌和猪支气管败血波氏杆菌标准样品的基因组DNA拷贝数，将猪链球菌、副猪嗜血杆菌和猪支气管败血波氏杆菌标准样品分别稀释成106、105、104、103、102数量级拷贝数；步骤二、以步骤一得到的不同浓度的猪链球菌、副猪嗜血杆菌和猪支气管败血波氏杆菌基因组不同浓度的标准样品和提取的待测样品为模板，分别用权利要求1所述的引物Suis-gdhQF、Suis-gdhQR、HPSQF、HPSQR、BBQF和BBQR，及权利要求1或权利要求2所述的探针Suis-gdhQP、HPSQP和BBQP进行荧光定量PCR扩增反应；步骤三、根据荧光定量PCR扩增Cq值和反应荧光信号变化及强度，对待测样品中的猪链球菌、副猪嗜血杆菌和猪支气管败血波氏杆菌中的目标基因进行定性和定量分析。进一步的，步骤一和步骤二中，荧光定量PCR扩增反应体系包括：2×PremixExTaq(ProbeqPCR)10μL，引物Suis-gdhQF、Suis-gdhQR、HPSQF、HPSQR、BBQR和BBQF的终浓度分别为0.3μM，探针Suis-gdhQP、HPSQP和BBQP的终浓度分别为0.15μM，DNA模板2μL，双蒸水补足扩增反应体系至20μL。进一步的，步骤一和步骤二中，荧光定量PCR扩增程序为：95℃预变性3min，95℃变性10s，56℃退火30s，循环40次。进一步的，步骤三中，结果分析包括定性分析和定量分析，分析的具体过程为：1）定性分析：出现探针Suis-gdhQP5’端标记的荧光基团X1的荧光扩本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.猪链球菌、副猪嗜血杆菌和猪支气管败血波氏杆菌三重荧光PCR检测的引物和探针，其特征在于：引物的核苷酸序列为：/n猪链球菌上游引物Suis-gdh QF：5’-GTCATGGACTCGTGAAGAAGTAG-3’ （SEQ ID NO:1）；/n猪链球菌下游引物Suis-gdh QR： 5’-GTAGTCTGTACCAAGGTCGTATTT-3’ （SEQ ID NO:2）；/n副猪嗜血杆菌上游引物HPS QF：5’-GCGTAGTATCGGGAGATGAAAG-3’ （SEQ ID NO:3）；/n副猪嗜血杆菌下游引物HPS QR：5’-TAGAGATCGTCGGCTTGGTAGG-3’ （SEQ ID NO:4）；/n猪支气管败血波氏杆菌上游引物BB QF：5’-GGCTTCTTCAAACCGGGCAGCT-3’ （SEQ IDNO:5）；/n猪支气管败血波氏杆菌下游引物BB QR： 5’-GTCGCAAACCTGCCGTAATCCAG-3’ （SEQ IDNO:6）；/n探针的核苷酸序列为：/n猪链球菌特异探针Suis-gdh QP：5’- X1-TTGGCTGTGTTGAAGATGTTGGCC-Y1-3’ （SEQ IDNO:7）；/n副猪嗜血杆菌特异探针HPS QP： 5’-X2-ACCGCAAGGCCAGTTGCCATAAGAT-Y2-3’ （SEQ IDNO:8）；/n猪支气管败血波氏杆菌的特异探针BB QP：5’-X3-CCGCCCATCTGTAACATCGGACTT-Y3-3’（SEQ ID NO:9）。/n...

【技术特征摘要】
1.猪链球菌、副猪嗜血杆菌和猪支气管败血波氏杆菌三重荧光PCR检测的引物和探针，其特征在于：引物的核苷酸序列为：
猪链球菌上游引物Suis-gdhQF：5’-GTCATGGACTCGTGAAGAAGTAG-3’（SEQIDNO:1）；
猪链球菌下游引物Suis-gdhQR：5’-GTAGTCTGTACCAAGGTCGTATTT-3’（SEQIDNO:2）；
副猪嗜血杆菌上游引物HPSQF：5’-GCGTAGTATCGGGAGATGAAAG-3’（SEQIDNO:3）；
副猪嗜血杆菌下游引物HPSQR：5’-TAGAGATCGTCGGCTTGGTAGG-3’（SEQIDNO:4）；
猪支气管败血波氏杆菌上游引物BBQF：5’-GGCTTCTTCAAACCGGGCAGCT-3’（SEQIDNO:5）；
猪支气管败血波氏杆菌下游引物BBQR：5’-GTCGCAAACCTGCCGTAATCCAG-3’（SEQIDNO:6）；
探针的核苷酸序列为：
猪链球菌特异探针Suis-gdhQP：5’-X1-TTGGCTGTGTTGAAGATGTTGGCC-Y1-3’（SEQIDNO:7）；
副猪嗜血杆菌特异探针HPSQP：5’-X2-ACCGCAAGGCCAGTTGCCATAAGAT-Y2-3’（SEQIDNO:8）；
猪支气管败血波氏杆菌的特异探针BBQP：5’-X3-CCGCCCATCTGTAACATCGGACTT-Y3-3’（SEQIDNO:9）。


2.根据权利要求1所述的猪链球菌、副猪嗜血杆菌和猪支气管败血波氏杆菌三重荧光PCR检测的引物和探针，其特征在于：探针序列5’端标记的荧光基团X1、X2和X3分别为FAM、HEX、CY5、JOE、ROX中的一种，且X1、X2、X3互不相同，探针序列3’端标记的淬灭基团Y1、Y2和Y3分别为BHQ1、BHQ2、BHQ3、TAMRA中的一种。


3.根据权利要求2所述的猪链球菌、副猪嗜血杆菌和猪支气管败血波氏杆菌三重荧光PCR检测的引物和探针，其特征在于：
猪链球菌特异探针Suis-gdhQP：5’-FAM-TTGGCTGTGTTGAAGATGTTGGCC-BHQ2-3’；
副猪嗜血杆菌特异探针HPSQP：5’-HEX-ACCGCAAGGCCAGTTGCCATAAGAT-BHQ1-3’；
猪支气管败血波氏杆菌特异探针BBQP：5’-CY5-CCGCCCATCTGTAACATCGGACTT-BHQ2-3’。


4.根据权利要求1所述的猪链球菌、副猪嗜血杆菌和猪支气管败血波氏杆菌的引物和探针的三重...

【专利技术属性】
技术研发人员：易力，汪洋，东笑，王少辉，史明艳，王育娜，杨伟平，
申请(专利权)人：洛阳师范学院，
类型：发明
国别省市：河南;41