用于检测副溶血弧菌的PCR检测体系、试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术涉及一种用于检测副溶血弧菌的PCR检测体系、试剂盒及检测方法，PCR检测体系包括用于检测tlh基因的第一引物对和第一检测探针、用于检测tdh基因的第二引物对和第二检测探针以及用于检测ureR基因的第三引物对和第三检测探针。本发明专利技术的用于检测副溶血弧菌的PCR检测体系基于tlh、tdh、ureR三个基因同时检测，可以精准地区分副溶血弧菌的具体类型。该PCR检测体系的兼容性好，特异性和灵敏度很高，检测限达到了15copies/ml。同时，该PCR检测体系可直接以细胞为模板进行检测，检测效果与以DNA为模板检测的效果相当，因此能够实现从样品到检测这样的一步法，不需要对样品进行DNA提取操作。

PCR detection system, kit and method for detection of Vibrio parahaemolyticus

【技术实现步骤摘要】
用于检测副溶血弧菌的PCR检测体系、试剂盒及检测方法
本专利技术涉及生物化学领域，特别是涉及一种用于检测副溶血弧菌的PCR检测体系、试剂盒及检测方法。
技术介绍
副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus，Vp)是革兰氏阴性嗜盐性细菌，属弧菌科弧菌属，广泛存在于近海岸的海水、螃蟹、虾、鲭鱼、沙丁鱼、鳕鱼、扇贝、牡蛎等海产品和盐渍食品中，是引起海产品弧菌病的主要病原菌之一，也是一种重要的食源性致病菌。使用传统培养方法检测临床和食品样品中的毒力菌株可以符合实际计数要求，但因毒性菌株没有明显的生长表型，可能不能与非毒力菌株区分开来。海产品中副溶血性弧菌的检出率很高，有时可达100％。但自然环境中分离的副溶血性弧菌有95％是非致病性的，仅有5％的是致病性的。海产品经冷冻或冷藏、烹调等加工处理后，副溶血性弧菌可能处于活的非可培养的状态，但致病性副溶血性弧菌携带的耐热溶血毒素(thermostabledirecthaemolysin,TDH)和耐热直接溶血毒素相关溶血毒素(TDH-relatedhaemolysin,TRH)依然存在。统计显示，人们食用海产品引发的腹泻率远低于海产品的携带率。为此，筛检出致病性副溶血性弧菌，比只检出副溶血性弧菌更有价值。对于副溶血弧菌的检测，我国目前采用的国标法GB4789.7-2013《食品安全国家标准食品微生物学检验(副溶血性弧菌检验)》使用常规检测方法，仍然是选择性培养、生化鉴定、神奈川现象和血清学反应等，但是这些检测方法不但操作繁琐、耗时长，而且检出率低。随着生物学技术的快速发展，已有多种生物学技术用于副溶血弧菌的检测，例如PCR技术，但针对单个基因进行副溶血弧菌PCR检测很可能出现假阳性(非副溶血弧菌计入)或假阴性(致病性副溶血弧菌漏检)等问题，特异性不高，无法区分副溶血弧菌的具体种类。
技术实现思路
基于此，有必要提供一种灵敏度高、特异性好且可区分副溶血弧菌的具体种类的PCR检测体系。一种用于检测副溶血弧菌的PCR检测体系，包括用于检测tlh基因的第一引物对和第一检测探针、用于检测tdh基因的第二引物对和第二检测探针以及用于检测ureR基因的第三引物对和第三检测探针，所述第一检测探针、所述第二检测探针和所述第三检测探针的5’端均连接有荧光报告基团，3’端均连接有荧光淬灭基团，且最多有两个探针的荧光报告基团相同；所述第一引物对的序列如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示，所述第一检测探针的序列如SEQIDNO.3所示，所述第二引物对的序列如SEQIDNO.4和SEQIDNO.5所示，所述第二检测探针的序列如SEQIDNO.6所示，所述第三引物对的序列如SEQIDNO.7和SEQIDNO.8所示，所述第三检测探针的序列如SEQIDNO.9所示。在其中一个实施例中，还包括用于检测orf8基因的第四引物对和第四检测探针，所述第四引物对的序列如SEQIDNO.10和SEQIDNO.11所示，所述第四检测探针的序列如SEQIDNO.12所示；所述第四检测探针的5’端连接有荧光报告基团，3’端连接有荧光淬灭基团，且所述第一检测探针、所述第二检测探针、所述第三检测探针和所述第四检测探针中最多有两个探针的荧光报告基团相同。在其中一个实施例中，所述荧光报告基团选自Alexa350、CF350、FAM、Alexa488、CF488、HEX、VIC、Alexa532、CF532、ROX、Cal610、TexasRed、Alexa594、CF594、CY5、Quasar670、Alexa647、CF647、Quasar705、Alexa680或CF680，所述荧光淬灭基团选自TAMRA、BHQ1、BHQ2或MGB。在其中一个实施例中，所述第一检测探针连接的荧光报告基团和荧光淬灭基团分别为FAM和BHQ1，所述第二检测探针连接的荧光报告基团和荧光淬灭基团分别为VIC和BHQ2，所述第三检测探针连接的荧光报告基团和荧光淬灭基团分别为FAM和BHQ1，所述第四检测探针连接的荧光报告基团和荧光淬灭基团分别为VIC和BHQ2。本专利技术还提供了一种用于检测副溶血弧菌的试剂盒，包括所述用于检测副溶血弧菌的PCR检测体系。在其中一个实施例中，还包括PCR反应缓冲液、Mg2+试剂、dNTPs以及TaqDNA聚合酶中的至少一种。本专利技术还提供了一种用于检测副溶血弧菌的检测方法，使用所述用于检测副溶血弧菌的PCR检测体系，所述检测方法包括以下步骤：以待测样品为模板材料，以各引物对作为扩增引物，并加入各检测探针进行PCR反应，分析得到检测结果。在其中一个实施例中，所述PCR检测体系包括所述第一引物对、所述第一检测探针、所述第二引物对、所述第二检测探针、所述第三引物对、所述第三检测探针、序列如SEQIDNO.10和SEQIDNO.11所示的第四引物对以及序列如SEQIDNO.12所示的第四检测探针；在所述PCR反应的反应体系中，各引物对的使用浓度为200nM～1500nM，所述第一检测探针的使用浓度为0.1μM～0.3μM，所述第二检测探针的使用浓度为0.2μM～1μM，所述第三检测探针的使用浓度为0.2μM～0.6μM，所述第四检测探针的使用浓度为0.4μM～2μM。在其中一个实施例中，所述PCR反应为微滴式数字荧光PCR反应。在其中一个实施例中，所述PCR反应的热裂解条件为：92℃～98℃，25min～35min。本专利技术的用于检测副溶血弧菌的PCR检测体系基于tlh、tdh、ureR三个基因同时检测，检测结果可以得到清晰的8个分区，从而精准地区分副溶血弧菌的具体类型。通过多种类型的副溶血弧菌和非副溶血弧菌的验证，证明了上述PCR检测体系的可行性和特异性，兼容性好且灵敏度很高，检测限达到了15copies/ml。同时，本专利技术的用于检测副溶血弧菌的PCR检测体系可直接以细胞为模板进行检测，检测效果与以DNA为模板检测的效果相当，因此能够实现从样品到检测这样的一步法，不需要对样品进行DNA提取操作，避免了DNA提取过程中的样品损失，极大地简化了操作，而且能够明确菌细胞中各基因间的联系。附图说明图1为实施例1的ddPCR结果图；图2为实施例2的ddPCR结果图；图3为实施例3的ddPCR结果图；图4为实施例4的不同第二检测探针浓度的一维散点图；图5为实施例5的以gDNA为模板和以完整单细胞为模板的qPCR结果图；图6为实施例7中以完整细胞为模板并采用不同的热裂解时间的ddPCR结果图，其中A为热裂解时间15min，B为热裂解时间25min；图7为实施例7中以gDNA为模板并采用不同的热裂解时间的ddPCR结果图，其中A为热裂解时间15min，B为热裂解时间25min。具体实施方式为了便于理解本专利技术，下面将对本专利技术进行更全面的描述，并给出了本专利技术的较佳实施例。但是，本专利技术可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测副溶血弧菌的PCR检测体系，其特征在于，包括用于检测tlh基因的第一引物对和第一检测探针、用于检测tdh基因的第二引物对和第二检测探针以及用于检测ureR基因的第三引物对和第三检测探针，所述第一检测探针、所述第二检测探针和所述第三检测探针的5’端均连接有荧光报告基团，3’端均连接有荧光淬灭基团，且最多有两个探针的荧光报告基团相同；所述第一引物对的序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，所述第一检测探针的序列如SEQ ID NO.3所示，所述第二引物对的序列如SEQ ID NO.4和SEQ IDNO.5所示，所述第二检测探针的序列如SEQ ID NO.6所示，所述第三引物对的序列如SEQ IDNO.7和SEQ ID NO.8所示，所述第三检测探针的序列如SEQ ID NO.9所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于检测副溶血弧菌的PCR检测体系，其特征在于，包括用于检测tlh基因的第一引物对和第一检测探针、用于检测tdh基因的第二引物对和第二检测探针以及用于检测ureR基因的第三引物对和第三检测探针，所述第一检测探针、所述第二检测探针和所述第三检测探针的5’端均连接有荧光报告基团，3’端均连接有荧光淬灭基团，且最多有两个探针的荧光报告基团相同；所述第一引物对的序列如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示，所述第一检测探针的序列如SEQIDNO.3所示，所述第二引物对的序列如SEQIDNO.4和SEQIDNO.5所示，所述第二检测探针的序列如SEQIDNO.6所示，所述第三引物对的序列如SEQIDNO.7和SEQIDNO.8所示，所述第三检测探针的序列如SEQIDNO.9所示。


2.根据权利要求1所述的PCR检测体系，其特征在于，还包括用于检测orf8基因的第四引物对和第四检测探针，所述第四引物对的序列如SEQIDNO.10和SEQIDNO.11所示，所述第四检测探针的序列如SEQIDNO.12所示；所述第四检测探针的5’端连接有荧光报告基团，3’端连接有荧光淬灭基团，且所述第一检测探针、所述第二检测探针、所述第三检测探针和所述第四检测探针中最多有两个探针的荧光报告基团相同。


3.根据权利要求2所述的PCR检测体系，其特征在于，所述荧光报告基团选自Alexa350、CF350、FAM、Alexa488、CF488、HEX、VIC、Alexa532、CF532、ROX、Cal610、TexasRed、Alexa594、CF594、CY5、Quasar670、Alexa647、CF647、Quasar705、Alexa680或CF680，所述荧光淬灭基团选自TAMRA、BHQ1、BHQ2或MGB。


4.根据权利要求3所述的PCR检测体系，其特征在于，所述第一检测探针连接的荧光报告...

【专利技术属性】
技术研发人员：古晓奎，钟青萍，雷舒文，
申请(专利权)人：广东顺德工业设计研究院广东顺德创新设计研究院，华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东;44