微生物的检测装置和检测方法制造方法及图纸

本发明专利技术涉及一种微生物的检测装置和检测方法。该微生物的检测方法包括以下步骤：将待测样本采用液滴生成技术形成多个液滴，每个液滴中包裹有包含PCR反应剂和至多一个微生物的反应液；PCR反应试剂包括用于扩增目标微生物的基因片段的引物和与引物对应的检测探针，检测探针上连接有信号物质；及将各个液滴中的反应液进行裂解反应和PCR反应后，检测反应结束后的液滴中信号物质的信号强度，并根据信号强度确定含有目标微生物的液滴数量以确定待测样本中的目标微生物的数量。上述的检测方法快速鉴定微生物的种类并精确定量。速鉴定微生物的种类并精确定量。速鉴定微生物的种类并精确定量。

【技术实现步骤摘要】
微生物的检测装置和检测方法


[0001]本专利技术涉及微生物检测技术，特别是涉及一种微生物的检测装置和检测方法。

技术介绍

[0002]传统的微生物分类鉴别方法主要是培养法，具有包括以下三种：(1)直接显微镜观察：正常情况，在一定的培养条件下(相同的培养基、温度以及培养时间)，同种微生物表现出稳定的菌落特征，可以通过显微镜观察菌落特征对微生物种类进行判断。(2)选择培养基培养微生物或人为提供有利于目的菌株生长的条件。选择培养基的作用是允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他微生物生长。选择培养一般是通过观察微生物的同化作用类型或某一特征进行间接判断，得到的微生物往往并不只有一种，但是能够大致确定这些微生物存在的共有特征从而对其分类。(3)鉴别培养基：根据微生物的代谢特点，在培养基中加入某种指示剂或化学药品。与选择培养相比，鉴别培养基的鉴别结果范围比较小，一般可直接测定某微生物的种类。
[0003]然而培养法具有很大的局限性，此种方法需要在严格的实验条件下进行，且需要繁杂的人力和较长的检测时间(通常要耗时18h～24h)，出结果存在一定的滞后性，不利于水质检测和临床应用的快速简便的要求。并且，培养法得到的检测结果也只是一个估计数值，单位是CFU(菌落形成单位)无法实现准确的定量。

技术实现思路

[0004]基于此，有必要提供一种微生物的检测方法，该方法能够鉴定微生物的种类并能改善传统培养法耗时和无法定量的问题。
[0005]一种微生物的检测方法，包括以下步骤：
[0006]将待测样本采用液滴生成技术形成多个液滴，每个所述液滴中包裹有包含PCR反应剂和至多一个微生物的反应液；所述PCR反应试剂包括用于扩增目标微生物的基因片段的引物和与所述引物对应的检测探针，所述检测探针上连接有信号物质；及
[0007]将各个所述液滴中的反应液进行裂解反应和PCR反应后，检测反应结束后的液滴中信号物质的信号强度，并根据所述信号强度确定含有目标微生物的液滴数量以确定待测样本中的目标微生物的数量。
[0008]上述的微生物的检测方法是一种基于液滴微流控和数字PCR技术的检测方法，该方法以液滴作为微反应室，对单个微生物细胞进行直接裂解、数字PCR扩增和检测，可以实现对不同的微生物、同种微生物不同基因型的检测，以及对待测微生物个数的精准定量，从而达到快速实现精确定量和分类鉴定。
[0009]在其中一个实施例中，所述信号物质包括荧光基团，所述荧光基团包括FAM、HEX、VIC、CY5、ROX、TexsaRed、JOE及Quasar705中的一种。
[0010]在其中一个实施例中，所述PCR反应试剂包括用于扩增目标微生物的不同基因片段的引物和对应的检测探针。
[0011]在其中一个实施例中，不同基因片段的检测探针上连接的信号物质相同，且不同的基因片段的检测探针的浓度不同；
[0012]或者不同基因片段的检测探针上连接的信号物质不同。
[0013]在其中一个实施例中，所述PCR反应试剂还包括缓冲剂、扩增酶和dNTP。
[0014]在其中一个实施例中，所述液滴的平均直径为100μm～120μm。
[0015]一种微生物的检测装置，包括：
[0016]液滴生成机构，用于将待测样本制成多个液滴，每个所述液滴中包裹有包含PCR反应剂和至多一个微生物的反应液；所述PCR反应试剂包括用于扩增目标微生物的引物和与所述引物对应的检测探针，所述检测探针上连接有信号物质；
[0017]PCR反应机构，用于对各个所述液滴中的反应液进行裂解反应和PCR反应；
[0018]检测机构，用于检测PCR反应结束后的液滴中的信号物质的信号强度；
[0019]数据采集与分析机构，与检测机构通讯连接，所述数据采集与分析机构用于采集所述检测机构的检测结果并进行统计分析。
[0020]在其中一个实施例中，所述信号物质为荧光基团，所述检测机构包括激光光源模块、第一二向色镜、反射镜、非球面透镜、第二二向色镜、第一检测模块和第二检测模块；
[0021]激光光源模块用于提供激光；
[0022]所述激光光源模块、所述第一二向色镜、所述反射镜和所述非球面透镜形成用于激发液滴发出荧光的第一光路；
[0023]所述非球面透镜、所述反射镜、所述第一二向色镜和所述第二二向色镜形成供所述第一检测模块或第二检测模块检测所述荧光的第二光路；
[0024]所述第一检测模块和所述第二检测模块分别独立地与所述数据采集与分析机构通讯连接，所述数据采集与分析机构用于收集并分析所述第一检测模块和所述第二检测模块的检测结果。
[0025]在其中一个实施例中，所述第一检测模块包括第一滤光片、第一球面透镜、第一小孔和第一荧光探测器，经所述第二向色镜反射的荧光依次经过所述第一滤光片、所述第一球面透镜和所述第一小孔后被所述第一荧光探测器检测，所述第一荧光探测器与所述数据采集与分析模块通讯连接；
[0026]所述第二检测模块包括第二滤光片、第二球面透镜、第二小孔和第二荧光探测器，经所述第二向色镜透射的荧光依次经过所述第二滤光片、所述第二球面透镜和所述第二小孔后被所述第二荧光探测器检测，所述第二荧光探测器与所述数据采集与分析模块通讯连接。
[0027]在其中一个实施例中，所述激光模块包括激光器、激光模块小孔和激光模块滤光片，所述激光器产生的激光依次经所述激光模块小孔和所述激光模块滤光片后到达所述第一二向色镜，并经所述第一二向色镜和所述反射镜反射、所述非球面透镜聚焦后形成用于激发液滴发出荧光的激光；
[0028]或者，所述液滴生成机构为微流控芯片。
附图说明
[0029]为了更清楚地说明本专利技术实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使
用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图，其中：
[0030]图1为一实施例的微生物的检测装置的工作原理图；
[0031]图2为一实施例的微生物的检测装置的荧光检测原理图；
[0032]图3～图4为实施例1中rfbE、eae以试剂盒提取的基因组DNA为模板ddPCR一维图；
[0033]图5～图6为实施例1中rfbE、eae基因以单个细胞为模板ddPCR一维图；
[0034]图7为实施例1中以试剂盒提取的DNA为模板的ddPCR二维聚类图(以基因组DNA提取试剂盒提取的DNA为模板，目的基因为rfbE和eae)；
[0035]图8为实施例1中以完整单个细胞为模板的ddPCR二维聚类图(免DNA提取以单个完整的细胞直接裂解释放DNA为模板，目的基因为rfbE和eae)。
[0036]附图标记：
[0037]110、液滴生成机构；121、激光光源模块；122、第一二向色镜；123、反射镜；124、非球面透镜；125、第二二向本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种微生物的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：将待测样本采用液滴生成技术形成多个液滴，每个所述液滴中包裹有包含PCR反应剂和至多一个微生物的反应液；所述PCR反应试剂包括用于扩增目标微生物的基因片段的引物和与所述引物对应的检测探针，所述检测探针上连接有信号物质；及将各个所述液滴中的反应液进行裂解反应和PCR反应后，检测反应结束后的液滴中信号物质的信号强度，并根据所述信号强度确定含有目标微生物的液滴数量以确定待测样本中的目标微生物的数量。2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述信号物质包括荧光基团，所述荧光基团包括FAM、HEX、VIC、CY5、ROX、Texsa Red、JOE及Quasar705中的一种。3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述PCR反应试剂包括用于扩增目标微生物的不同基因片段的引物和对应的检测探针。4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，不同基因片段的检测探针上连接的信号物质相同，且不同的基因片段的检测探针的浓度不同；或者不同基因片段的检测探针上连接的信号物质不同。5.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述PCR反应试剂还包括缓冲剂、扩增酶和dNTP。6.根据权利要求1～5中任一项所述的检测方法，其特征在于，所述液滴的平均直径为100μm～120μm。7.一种微生物的检测装置，其特征在于，包括：液滴生成机构，用于将待测样本制成多个液滴，每个所述液滴中包裹有包含PCR反应剂和至多一个微生物的反应液；所述PCR反应试剂包括用于扩增目标微生物的引物和与所述引物对应的检测探针，所述检测探针上连接有信号物质；PCR反应机构，用于对各个所述液滴中的反应液进行裂解反应和PCR反应；检测机构，用于检测PCR反应结束后的液滴中的信号物质的信号强度；数据采集与分析机...

【专利技术属性】
技术研发人员：关烨锋，彭洁，黄旭光，廖丽敏，颜宇东，刘华敏，
申请(专利权)人：广东顺德工业设计研究院广东顺德创新设计研究院，
类型：发明
国别省市：