一种糜蛋白酶的提取纯化方法技术

本发明专利技术涉及一种糜蛋白酶的提取纯化方法。本发明专利技术采用硫酸溶液从动物胰脏中提取糜蛋白酶，经硫酸铵一次沉淀杂蛋白后进行疏水层析和亲和层析，具有工艺时间短，操作简便的优点。纯化过程可以使糜蛋白酶理化性质和生物活性保持稳定，最终使糜蛋白酶的各项指标均符合中国药典标准。通过工艺优化，糜蛋白酶效价提高到2700U/mg以上。

Extraction and purification of chymotrypsin

【技术实现步骤摘要】
一种糜蛋白酶的提取纯化方法
本专利技术属于蛋白质的提取纯化领域，具体涉及一种糜蛋白酶的提取纯化方法。
技术介绍
糜蛋白酶又称胰凝乳蛋白酶，系从牛或猪胰中提取的一种蛋白酶，属于丝氨酸肤链内切酶，其催化中心内的专一性袋穴比较宽，并且完全由疏水侧链排列而成，因而能接纳庞大的芳香族氨基酸的侧链基团，主要作用于芳香族如酪氨酸、苯丙氨酸及脂肪族侧链较长的大体积疏水性氨基酸如甲硫氨酸等氨基酸形成的肤键。糜蛋白酶可以分解炎症部位纤维蛋白的凝结物，促进血凝块、脓性分泌物及坏死组织的溶化分解，从而净化创面，使肉芽组织新生，促进伤口愈合。在国外，该药在眼科、皮肤科做临床局部应用己被肯定。国内临床上主要用于眼科手术，也可用于创口或局部炎症，以减少局部分泌和水肿。此外糜蛋白酶对腰椎间盘突出症、骨伤、皮肤慢性溃疡等疾病也有疗效。糜蛋白酶的传统制备方法为结晶法，结晶法是先将胰脏进行酸提取，提取液进行分段盐析，除去含杂蛋白的上清夜，盐析得到的沉淀即为糜蛋白酶原粗品。后续步骤与结晶法相似，将粗品糜蛋白酶原再次分段盐析纯化后用胰蛋白酶激活，酶的活化液用硫酸铵低温结晶后透析、冻干后即得。多重结晶及分段盐析方法工艺复杂、试剂消耗量大、结晶耗时长，纯化效果差，而且糜蛋白酶比活和收率都不高。由此可见，由此可见，提供一种工艺时间短、操作简便、成本低、纯化效果好的糜蛋白酶的提取纯化方法成为本领域技术人员亟待解决的技术问题。
技术实现思路
鉴于现有技术多采用多重结晶及分级盐析的操作来纯化糜蛋白酶，存在结晶时间长，盐析使用硫酸铵过多等缺点。本专利技术提供了一种糜蛋白酶的提取纯化方法，具体为：(1)将动物胰脏绞碎成浆后，加入硫酸溶液进行提取，然后进行过滤并收集滤液1；(2)在所述滤液1中加入硫酸铵进行沉淀，然后进行过滤并收集滤液2；(3)将所述滤液2进行超滤浓缩后，得到浓缩液，在所述浓缩液中加入胰蛋白酶进行活化处理；(4)将所述活化处理后的浓缩液上样至疏水层析柱，进行洗脱处理并收集洗脱流出液，得馏分1；(5)将所述馏分1进行超滤换盐后，上样至亲和层析柱，进行洗脱处理并收集洗脱流出液，得馏分2；(6)将所述馏分2进行超滤换盐后，冻干，得到糜蛋白酶成品。优选的，所述加入硫酸溶液进行提取，具体为：所述硫酸溶液浓度为0.05-0.1mol/L，所述硫酸溶液使用量为每kg胰脏加入1-1.5L，并进行搅拌提取，所述搅拌提取时间为8-10小时。优选的，所述步骤(2)，具体为：在所述滤液1中加入所述硫酸铵至饱和度为30-40％，静置6-8小时后进行过滤并收集所述滤液2。优选的，在所述浓缩液中加入胰蛋白酶进行活化处理，具体为：调节所述浓缩液pH为7.5-8.0，加入胰蛋白酶活化后，加等体积纯化水稀释。优选的，在所述步骤(4)中：所述疏水层析柱填料为ButylSepharose4FastFlow，所述平衡处理中使用的平衡液为0.02MPB+1.5M(NH4)2SO4；所述洗脱处理中使用的洗脱液为0.02MPB+0.5M(NH4)2SO4。优选的，在所述步骤(5)中：所述亲和层析柱填料为CaptoBlue，所述平衡处理中使用的平衡液为0.2MTris-Hcl；所述洗脱处理中使用的洗脱液为0.2MTris-Hcl+1.5MKCl。优选的，所述洗脱处理并收集洗脱流出液，具体为：用平衡液洗涤，至流出液280nm波长处吸光值A280不再下降，换用洗脱液洗脱，收集洗脱流出液，至流出液280nm波长处吸光值A280不再下降，停止收集。优选的，在所述步骤(5)中：所述馏分1超滤换盐所用换盐液为所述平衡液；所述馏分1超滤换盐后调节pH及电导率与平衡液一致：然后上样至亲和层析柱。优选的，在所述步骤(6)中：所述馏分2超滤换盐所用换盐液为0.01M乙酸铵溶液。优选的，所述超滤使用的超滤膜为10KD超滤膜。由此可见，与现有技术多采用多重结晶及分级盐析的操作来纯化糜蛋白酶相比，本专利技术采用硫酸溶液从胰脏中提取糜蛋白酶，经硫酸铵一次沉淀杂蛋白后进行疏水层析和亲和层析，以此代替多重结晶及分级盐析的操作，具有工艺时间短，操作简便的优点，纯化过程可以使糜蛋白酶理化性质和生物活性保持稳定，最终使糜蛋白酶的各项指标均符合中国药典标准。通过工艺优化，糜蛋白酶效价提高到2700U/mg以上。附图说明为了更清楚地说明本专利技术的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为本专利技术实施例提供的一种糜蛋白酶的提取纯化方法流程示意图。具体实施方式鉴于现有技术多采用多重结晶及分级盐析的操作来纯化糜蛋白酶，存在结晶时间长，盐析使用硫酸铵过多等缺点。本专利技术提供了一种糜蛋白酶的提取纯化方法，采用硫酸溶液从胰脏中提取糜蛋白酶，经硫酸铵一次沉淀杂蛋白后进行疏水层析和亲和层析，以此代替多重结晶及分级盐析的操作。下面将结合实施例，对本专利技术中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本专利技术的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。实施例1如图1所示，本专利技术提供了一种糜蛋白酶的提取纯化方法。该方法的具体实施过程如下：步骤101：将动物胰脏绞碎成浆后，加入硫酸溶液进行提取，然后进行过滤并收集滤液1。其中，结合具体实施场景，所述动物胰脏可选用新鲜的猪胰或牛胰，并去除脂肪及结缔组织，洗净后用绞肉机绞碎，所述硫酸溶液浓度可以为0.05-0.1mol/L，所述硫酸溶液使用量可以为每kg胰脏加入1-1.5L，并进行搅拌提取8-10小时。步骤102：在所述滤液1中加入硫酸铵进行沉淀，然后进行过滤并收集滤液2。其中，结合具体实施场景，所述硫酸铵可以选择固体硫酸铵，在所述滤液1中加入所述硫酸铵至饱和度为30-40％，通过静置6-8小时进行沉淀，然后过滤并收集所述滤液2。步骤103：将所述滤液2进行超滤浓缩后，得到浓缩液，在所述浓缩液中加入胰蛋白酶进行活化处理。步骤104：将所述活化处理后的浓缩液上样至平衡处理后的疏水层析柱，进行洗脱处理并收集洗脱流出液，得馏分1。步骤105：将所述馏分1进行超滤换盐后，上样至平衡处理后的亲和层析柱，进行洗脱处理并收集洗脱流出液，得馏分2。步骤106：将所述馏分2进行超滤换盐后，冻干，得到糜蛋白酶成品。其中，结合具体实施场景，上述步骤中超滤使用的超滤膜可以为10KD超滤膜；洗脱处理操作具体为：用平衡液洗涤，至洗涤流出液280nm波长处吸光值A280不再下降，换用洗脱液洗脱，收集洗脱流出液，至所述洗脱流出液280n本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种糜蛋白酶的提取纯化方法，其特征在于，所述方法具体为：/n(1)将动物胰脏绞碎成浆后，加入硫酸溶液进行提取，然后进行过滤并收集滤液1；/n(2)在所述滤液1中加入硫酸铵进行沉淀，然后进行过滤并收集滤液2；/n(3)将所述滤液2进行超滤浓缩，得到浓缩液，在所述浓缩液中加入胰蛋白酶进行活化处理；/n(4)将所述活化处理后的浓缩液上样至平衡处理后的疏水层析柱，进行洗脱处理并收集洗脱流出液，得馏分1；/n(5)将所述馏分1进行超滤换盐后，上样至平衡处理后的亲和层析柱，进行洗脱处理并收集洗脱流出液，得馏分2；/n(6)将所述馏分2进行超滤换盐后，冻干，得到糜蛋白酶成品。/n

【技术特征摘要】
1.一种糜蛋白酶的提取纯化方法，其特征在于，所述方法具体为：
(1)将动物胰脏绞碎成浆后，加入硫酸溶液进行提取，然后进行过滤并收集滤液1；
(2)在所述滤液1中加入硫酸铵进行沉淀，然后进行过滤并收集滤液2；
(3)将所述滤液2进行超滤浓缩，得到浓缩液，在所述浓缩液中加入胰蛋白酶进行活化处理；
(4)将所述活化处理后的浓缩液上样至平衡处理后的疏水层析柱，进行洗脱处理并收集洗脱流出液，得馏分1；
(5)将所述馏分1进行超滤换盐后，上样至平衡处理后的亲和层析柱，进行洗脱处理并收集洗脱流出液，得馏分2；
(6)将所述馏分2进行超滤换盐后，冻干，得到糜蛋白酶成品。


2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述加入硫酸溶液进行提取，具体为：
所述硫酸溶液浓度为0.05-0.1mol/L，所述硫酸溶液使用量为每kg胰脏加入1-1.5L，并进行搅拌提取，所述搅拌提取时间为8-10小时。


3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)，具体为：
在所述滤液1中加入所述硫酸铵至饱和度为30-40％，静置6-8小时后进行过滤并收集所述滤液2。


4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述浓缩液中加入胰蛋白酶进行活化处理，具体为：
调节所述浓缩液pH为7.5-8.0，加入所述胰蛋白酶活化后，加等体积纯化水稀释。


5.如权利要求1所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：魏超娟，徐富勇，夏鑫水，纪明妹，饶志凯，
申请(专利权)人：江西浩然生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：江西;36