一种高产聚苹果酸的菌株及提高聚苹果酸产量的方法技术

本发明专利技术属于生物发酵技术领域，具体涉及一种高产聚苹果酸的菌株及提高聚苹果酸产量的方法，具体为产黑色素短梗霉(Aureobasidium melanogenum)BCSW‑001，已保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2019年11月22日，保藏编号为：CGMCC NO.18996；将产黑色素短梗霉活化后在含玉米浆的条件下发酵大幅度提高聚苹果酸产量，其方法简单，直接在发酵培养基中加入玉米浆，具有发酵成本低、产量高、技术经济性强等优点，可应用于聚苹果酸工业生产。

A strain with high yield of poly malic acid and the method to increase the yield of poly malic acid

【技术实现步骤摘要】
一种高产聚苹果酸的菌株及提高聚苹果酸产量的方法
本专利技术属于生物发酵
，具体涉及一种高产聚苹果酸的菌株及提高聚苹果酸产量的方法。
技术介绍
产黑色素短梗霉(Aureobasidiummelanogenum)是一类酵母真菌，具有菌丝体和酵母样两种形态。该菌种在自然界中存在较为广泛。产黑色素短梗霉发酵高分子产物中主要为聚苹果酸和普鲁兰多糖。聚苹果酸(Polymalicacid)以L-苹果酸为唯一单体在体内聚合而成，是一种新型完全生物降解性高分子材料，具有高度的生物相容性、生物降解性和生物可吸收性等优点。可用于药物缓控释载体、食品加工等领域。通常产黑色素短梗霉发酵过程会同时产生聚苹果酸和普鲁兰多糖两个大分子代谢产物。聚苹果酸和普鲁兰多糖的合成共同的前体有葡萄糖-1-磷酸，如碳代谢流进入以TCA循环或者乙酸循环积累苹果酸，最终聚合生成聚苹果酸。而碳代谢流经葡萄糖-1-磷酸转化为UDPG-葡萄糖，将最终合成普鲁兰多糖。由于产黑色素短梗霉发酵过程有两种转化途径，使得微生物发酵生产PMLA产量不高，而且极高的生产成本未能实现大规模的工业生产，以致影响了该物质的应用。中国专利CN101979499B提供了一种大量产生β-聚苹果酸的诱变菌株出芽短梗霉(Aureobasidiumpullulans)TKPM00006及利用该诱变菌株发酵生产聚苹果酸的方法，该菌株是以从我国宁夏回族自治区银川市王太堡果园土壤中筛选出的β-聚苹果酸生产菌TKPM10017的基础上采用多组复合诱变技术育出的高产β-聚苹果酸的诱变菌株。在优化条件下β-聚苹果酸产量达到18.4±1.3g/L。中国专利CN107674841A提供一种高产聚苹果酸的出芽短梗霉，其分类命名为出芽短梗霉(Aureobasidiumpullulans)GXZ-6，保藏编号为CCTCCNO：M2017517，保藏日期为2017年9月20日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学。本专利技术提供的出芽短梗霉GXZ-6可利用木薯淀粉、玉米淀粉、小麦淀粉、可溶性淀粉、淀粉糖化液、麦芽糖浆作为碳源发酵生产聚苹果酸，原料成本更低，且不存在高浓度碳源对菌体生长产生抑制作用的问题。在优化条件下β-聚苹果酸产量达60g/L。可以看出，聚苹果酸产量虽然在一定程度上有所提高，但产量仍然不是很高，生产成本较高，不能满足工业应用的需求。有鉴于此，本专利技术的目的在于提供玉米浆提高产黑色素短梗霉中聚苹果酸产量，降低生产成本的方法，通过摇床发酵得到玉米浆的最适添加量，然后利用5L发酵罐验证玉米浆对聚苹果酸发酵的影响。
技术实现思路
为了克服上述现有技术的不足，本专利技术公开了一种高产聚苹果酸的菌株及提高聚苹果酸产量的方法，具体为产黑色素短梗霉(Aureobasidiummelanogenum)，将产黑色素短梗霉活化后在含玉米浆的条件下发酵大幅度提高聚苹果酸产量，其方法简单，直接在发酵培养基中加入玉米浆，具有发酵成本低、产量高、技术经济性强等优点，可应用于聚苹果酸工业生产。为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：本专利技术提供了一种高产聚苹果酸的菌株，其特征在于：该菌株的分类命名为产黑色素短梗霉(Aureobasidiummelanogenum)BCSW-001，已保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2019年11月22日，保藏编号为：CGMCCNO.18996。本专利技术的产黑色素短梗霉(Aureobasidiummelanogenum)BCSW-001菌体形态主要为：酵母样形态，细胞椭圆形，大小均匀，数个菌体可连成链状，芽分生孢子；菌落形态特征为:最初粘稠、乳白色，最终为黑色，菌落质地粘稠湿润，色泽黑亮；培养特征为:25℃，180-200r/m下振荡培养5-6d，发酵液颜色最终稳定为黄色，不产黑色素；可以利用的碳源有：葡萄糖、麦芽糖、蔗糖其中之一；可以利用的氮源有：硝酸钠、硫酸铵、蛋白胨、酵母膏及玉米浆中的一种或几种。本专利技术还提供了一种提高聚苹果酸产量的方法，包括如下步骤：(1)菌种活化：将保藏编号为CGMCCNO.18996产黑色素短梗霉(Aureobasidiummelanogenum)转接至斜面培养基中活化；(2)种子培养：选取生长良好的斜面种子用无菌生理盐水洗下孢子，制备孢子悬浮液，将孢子悬浮液转接种到种子培养基中培养，制得种子培养液；(3)发酵培养：将种子培养液接种到含有玉米浆的发酵培养基中发酵培养；(4)聚苹果酸提取：将步骤(3)所得的发酵液离心后取上清液，加入硫酸水解。作为本专利技术的优选，所述步骤(1)中，菌种活化条件为:在25℃下恒温培养3-5d；所述斜面培养基各组分及含量如下：20％土豆，2％葡萄糖，2％琼脂粉，121℃灭菌20min。作为本专利技术的优选，所述步骤(2)中，将产黑色素短梗霉的孢子悬浮液接种量接种到种子培养基中，在温度为22～28℃、转速为180～250rpm的条件下培养38～50小时；所述种子培养基各组分及含量如下：蔗糖60～150g/L，酵母膏2～5g/L，丁二酸1～3g/L，硫酸铵0.5～1.5g/L，碳酸钾0.2～0.6g/L，磷酸二氢钾0.08～0.12g/L，硫酸镁0.08～0.12g/L，硫酸锌0.02～0.08g/L，玉米浆1mL/L，碳酸钙10～30g/L，溶剂为水，121℃灭菌20min。作为本专利技术的进一步优选，所述步骤(2)中，将产黑色素短梗霉的孢子悬浮液按5％(V/V)接种量接种到种子培养基中，在温度为25℃、转速为200rpm条件下培养40h；所述种子培养基各组分及含量为：蔗糖140g/L，酵母膏3g/L，丁二酸2g/L，硫酸铵1g/L，碳酸钾0.4g/L，磷酸二氢钾0.1g/L，硫酸镁0.1g/L，硫酸锌0.05g/L，玉米浆1mL/L，碳酸钙20g/L，溶剂为水，121℃灭菌20min。作为本专利技术的优选，所述步骤(3)中，将种子培养液以8％-10％(V/V)的接种量接种到含有玉米浆的发酵培养基中发酵培养；所述发酵培养基各组分及含量为：蔗糖80～200g/L，蛋白胨20～50g/L，磷酸二氢钾0.05～0.2g/L，硝酸钠1～4g/L，硫酸镁0.1～0.5g/L，氯化钾0.2～0.6g/L，硫酸锰0.02～0.07g/L，1.00～12.00g/L玉米浆，溶剂为水，121℃灭菌20min。作为本专利技术的优选，所述步骤(3)的发酵培养为摇瓶发酵培养或发酵罐发酵培养；摇瓶发酵培养时，发酵培养条件为：在温度为22～28℃、转速为180～250rpm的条件下培养90～150h；发酵罐发酵培养时，发酵培养条件为：在温度为22～28℃、转速为300～800rpm、通气比1:0.8～1:1.8条件下培养72～150h；作为本专利技术的进一步优选，摇瓶发酵培养时，发酵在温度25℃、转速为200rpm条件下培养144h；发酵罐发酵培养时，发酵在温度为25℃、转速为600rpm、通气比本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高产聚苹果酸的菌株，其特征在于：该菌株的分类命名为产黑色素短梗霉(Aureobasidium melanogenum)BCSW-001，已保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2019年11月22日，保藏编号为：CGMCC NO.18996。/n

【技术特征摘要】
1.一种高产聚苹果酸的菌株，其特征在于：该菌株的分类命名为产黑色素短梗霉(Aureobasidiummelanogenum)BCSW-001，已保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2019年11月22日，保藏编号为：CGMCCNO.18996。


2.根据权利要求1所述的菌株，其特征在于：其菌体形态主要为：酵母样形态，细胞椭圆形，大小均匀，数个菌体可连成链状，芽分生孢子；菌落形态特征为:最初粘稠、乳白色，最终为黑色，菌落质地粘稠湿润，色泽黑亮；培养特征为:25℃，180-200r/m下振荡培养5-6d，发酵液颜色最终稳定为黄色，不产黑色素；可以利用的碳源有：葡萄糖、麦芽糖、蔗糖其中之一；可以利用的氮源有：硝酸钠、硫酸铵、蛋白胨、酵母膏及玉米浆中的一种或几种。


3.一种利用权利要求1所述的菌株提高聚苹果酸产量的方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)菌种活化：将保藏编号为CGMCCNO.18996产黑色素短梗霉(Aureobasidiummelanogenum)转接至斜面培养基中活化；
(2)种子培养：选取生长良好的斜面种子用无菌生理盐水洗下孢子，制备孢子悬浮液，将孢子悬浮液转接种到种子培养基中培养，制得种子培养液；
(3)发酵培养：将种子培养液接种到含有玉米浆的发酵培养基中发酵培养；
(4)聚苹果酸提取：将步骤(3)所得的发酵液离心后取上清液，加入硫酸水解。


4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)中，菌种活化条件为：在25℃下恒温培养3-5d；所述斜面培养基各组分及含量如下：20％土豆，2％葡萄糖，2％琼脂粉，121℃灭菌20min。


5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述步骤(2)中，将产黑色素短梗霉的孢子悬浮液接种量接种到种子培养基中，在温度为22～28℃、转速为180～250rpm的条件下培养38～50小时；所述种子培养基各组分及含量如下：蔗糖60～150g/L，酵母膏2～5g/L，丁二酸1～3g/L，硫酸铵0.5～1.5g/L，碳酸钾0.2～0.6g/L，磷酸二...

【专利技术属性】
技术研发人员：乔长晟，张莹莹，牛雅倩，张琳，赵廷彬，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：天津;12