一株分泌双咪苯脲单克隆抗体的杂交瘤细胞株A11S及其应用制造技术

一株分泌双咪苯脲单克隆抗体的杂交瘤细胞株A11S及其应用，属于食品安全免疫检测领域。本发明专利技术经筛选得到一株分泌双咪苯脲单克隆抗体的杂交瘤细胞株A11S，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.18517。此细胞株分泌的单克隆抗体，对双咪苯脲具有较好的特异性和检测灵敏度（IC

A hybridoma cell line a11s secreting monoclonal antibody against imipenemide and its application

【技术实现步骤摘要】
一株分泌双咪苯脲单克隆抗体的杂交瘤细胞株A11S及其应用
本专利技术涉及一株分泌双咪苯脲单克隆抗体的杂交瘤细胞株A11S及其应用，属于食品安全免疫检测领域。
技术介绍
双眯苯脲（Imidocarb，IMI）又名咪唑苯脲，是当今国际公认的抗焦虫病药物，具有疗效高、毒性低、剂量小的特点。对牛、羊严重感染的巴贝西焦虫病，用咪唑苯脲治疗，病情可迅速得到控制，治疗三个月后未见复发。该品对焦虫病也有预防作用。临床资料还证实，该药对牛的锥虫病、附红细胞体病和人工感染的猪伊氏锥虫病、附红细胞体病疗效确实，并能控制疫情，但不能彻底杀灭附红细胞体。双咪苯脲已被广泛应用于猪、牛养殖和饲料等领域。因此双咪苯脲在牛肉、猪肉和饲料中一般都有一定的残留，而人体摄入双咪苯脲过多对人类的肝肾等器官会造成代谢负担，若在动物蛋白（牛肉、猪肉、牛奶）中，有双咪苯脲残留，则有害于人类健康。世界卫生组织食品添加剂专家联合委员会规定双咪苯脲在牛的肌肉和乳中的限量为50μg/kg。但是这些标准都采用高效液相色谱方法检测，检测方法较为繁琐、复杂，为了维护广大消费者的利益，有必要建立一种针对IMI的高效、快速的检测方法，而酶联免疫法（ELISA）前处理简单，成本低，可实现大量样品的快速检测，且检测时对样本的纯度要求不高。因此，建立高效的免疫学检测方法很有必要，而建立此方法的一个重要前提即需筛选出针对双咪苯脲的高特异性单克隆单体。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一株分泌双咪苯脲单克隆抗体的杂交瘤细胞株A11S及其应用，由该细胞株制备的单克隆抗体对双咪苯脲具有较好特异性和检测灵敏度，可以用来建立双咪苯脲的免疫学检测方法。本专利技术的技术方案，一株分泌双咪苯脲单克隆抗体的杂交瘤细胞株A11S，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2019年10月14日，保藏编号CGMCCNo.18517。双咪苯脲单克隆抗体，它由所述保藏编号为CGMCCNo.18517的分泌双咪苯脲单克隆抗体的杂交瘤细胞株A11S分泌产生。所述双咪苯脲单克隆抗体的应用，用于食品安全检测中双咪苯脲残留的分析检测。本专利技术提供的双咪苯脲单克隆抗体杂交瘤细胞株A11S的制备基本步骤为：（1）半抗原的选择：所述半抗原的结构简式如下：；具体采用双咪苯脲原药衍生出2-（3-氨基苯）咪唑啉；反应方程式如下：；（2）完全抗原IMI-BSA的制备：称取4.38mgIMI衍生物，溶解于300μLN,N-二甲基甲酰胺DMF中，冰水浴条件下搅拌反应10min；在冰水浴的条件下，滴加48μL、浓度为1M的HCl进行酸化0.5h，得到酸化好的IMI衍生物溶液；再称取150mg亚硝酸钠，用500μL纯水充分溶解得到亚硝酸钠溶液；将5.56μL亚硝酸钠溶液加入到酸化好的IMI衍生物溶液中，冰水浴条件下反应0.5-1h，称为A液；取6mgBSA，用2mL0.01M、pH=9.0的碳酸盐缓冲溶液CB溶解，称为B液；再逐滴将A液缓慢加入到B液中，冰水浴条件下反应4h；然后用0.01MPBS溶液透析，除去未反应的小分子半抗原，得到完全抗原IMI-BSA，并通过紫外吸收扫描方法进行鉴定；（3）小鼠的免疫：将IMI-BSA完全抗原与等量弗氏佐剂混合乳化后，对BALB/c小鼠进行颈背部皮下多点注射免疫（冲刺免疫除外）。首次免疫用完全弗氏佐剂，剂量为100μg/只；多次加强免疫用不完全弗氏佐剂且剂量减半即为50μg/只；冲刺免疫不用佐剂，直接用生理盐水稀释后腹腔注射，剂量再减半即为25μg/只。首次免疫与第二次加强免疫之间间隔一个月，多次加强免疫之间间隔21天，冲刺免疫与最后一次加强免疫之间间隔18-21天。通过间接竞争酶联免疫法（ic-ELISA）观测小鼠免疫效果即检测小鼠血清的效价和抑制；（4）细胞融合与细胞株建立：通过聚乙二醇（PEG4000）法将小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞进行融合，采用选择性培养基（HAT培养基）筛选出杂交瘤细胞，并用HT培养基进行细胞培养。融合一周后利用ic-ELISA法检测阳性细胞孔，并进一步利用ic-ELISA法测定阳性细胞孔的抑制效果，通过有限稀释法对抑制较好的阳性细胞孔进行亚克隆，一周后再次检测、挑孔、亚克隆。按上述方法进行三次亚克隆后获得IMI的高分泌特异抗体的单克隆杂交瘤细胞株A11S；（5）杂交瘤细胞株性质的鉴定：通过ic-ELISA测定灵敏度和特异性。本专利技术的有益效果：本专利技术提供的细胞株A11S分泌的单克隆抗体，对IMI具有较好的特异性和检测灵敏度（IC50值为2ng/mL），可实现对牛肉和猪肉、饲料中IMI残留量的检测，为食品中IMI残留的免疫检测提供了原料，具有实际应用价值。生物材料样品保藏：一株分泌双咪苯脲单克隆抗体的杂交瘤细胞株A11S，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2019年10月14日，保藏编号CGMCCNo.18517。附图说明图1双咪苯脲单克隆抗体的抑制标准曲线。具体实施方式本专利技术下面的实施例仅作为本
技术实现思路
的进一步说明，不能作为本专利技术的限定内容或范围。下面通过实施例对本专利技术作进一步说明。本专利技术通过将双咪苯脲完全抗原免疫小鼠，通过细胞融合，HAT选择性培养基培养，通过ic-ELISA筛选细胞上清，最终得到了针对双咪苯脲具有高分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株。实施例1杂交瘤细胞株A11S的制备（1）完全抗原的合成：称取4.38mgIMI衍生物，溶解于300μLN,N-二甲基甲酰胺DMF中，冰水浴条件下搅拌反应10min；在冰水浴的条件下，滴加48μL、浓度为1M的HCl进行酸化0.5h，得到酸化好的IMI衍生物溶液；再称取150mg亚硝酸钠，用500μL纯水充分溶解得到亚硝酸钠溶液；将5.56μL亚硝酸钠溶液加入到酸化好的IMI衍生物溶液中，冰水浴条件下反应0.5-1h，称为A液；取6mgBSA，用2mL0.01M、pH=9.0的碳酸盐缓冲溶液CB溶解，称为B液；再逐滴将A液缓慢加入到B液中，冰水浴条件下反应4h；然后用0.01MPBS溶液透析，除去未反应的小分子半抗原，得到完全抗原IMI-BSA，并通过紫外吸收扫描方法进行鉴定；（2）动物免疫：将完全抗原IMI-BSA与等量弗氏佐剂混合乳化后，对BALB/c小鼠进行颈背部皮下多点注射免疫（冲刺免疫除外）。首次免疫用完全弗氏佐剂，剂量为100μg/只；多次加强免疫用不完全弗氏佐剂且剂量减半即为50μg/只；冲刺免疫不用佐剂，直接用生理盐水稀释后腹腔注射，剂量再减半即为25μg/只。首次免疫与第二次加强免疫之间间隔一个月，多次加强免疫之间间隔21天，冲刺免疫与最后一次加强免疫之间间隔18-21天。通过间接竞争酶联免疫法（ic-ELISA）观本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一株分泌双咪苯脲单克隆抗体杂交瘤细胞株A11S，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2019年10月14日，保藏编号CGMCC No.18517。/n

【技术特征摘要】
1.一株分泌双咪苯脲单克隆抗体杂交瘤细胞株A11S，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2019年10月14日，保藏编号CGMCCNo.18517。


2.双咪苯脲单克隆抗体，其特征在于：它由权利要求1所述保藏编号为CGMCCNo.18517的分泌双咪苯脲单克隆抗体的杂交瘤细胞株A11S分泌产生。


3.权利要求2所述双咪苯脲单克隆抗体的应用，其特征在于：用于食品安全检测中双咪苯脲残留的分析检测。


4.权利要求1所述杂交瘤细胞株A11S的制备方法，其特征在于：其通过完全抗原双咪苯脲IMI-BSA免疫小鼠后，经过培养筛选出将两种不同的细胞小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞进行融合后的杂交细胞；再经过间接竞争酶联免疫法筛选细胞并三次亚克隆，得到杂交瘤细胞株A11S。


5.根据权利要求4所述杂交瘤细胞株A11S的制备方法，其特征在于所述完全抗原双咪苯脲IMI-BS...

【专利技术属性】
技术研发人员：胥传来，许晓昕，匡华，徐丽广，刘丽强，吴晓玲，宋珊珊，孙茂忠，郝昌龙，胡拥明，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32