一种无乳链球菌检测方法及其检测试剂盒技术

本发明专利技术公开了无乳链球菌检测方法，包括设计了如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2的引物对序列和生物素标记的一号探针和氨基修饰连接磁珠的二号探针序列，通过对样品中的DNA进行PCR扩增、核酸外切酶酶切、与一号探针进行链接、与二号探针进行杂交、进行发光检测的方式，可以高效、高特异性地检测无乳链球菌，具有较广的应用空间。

A detection method and kit for Streptococcus lactis

【技术实现步骤摘要】
一种无乳链球菌检测方法及其检测试剂盒
本专利技术涉及体外检测
，具体涉及无乳链球菌检测方法及其检测试剂盒。
技术介绍
无乳链球菌，又称为B组链球菌(GroupBStreptococcus,GBS)，是一种严重威胁新生儿的细菌，其主要存在于孕妇阴道的下1/3处，阴道入口处和肛门周围，而在阴道上1/3处和宫颈部相对较少。平时取阴道内分泌物做病原微生物培养时，一般都是取宫颈内口的分泌物做标本，但做无乳链球菌培养时，应该取阴道下1/3处的分泌物做标本检测，否则容易漏检。对于孕妇来说，这个细菌可以引起产前，产后的生殖道感染，主要表现为急性绒毛膜羊膜炎、产后子宫内膜炎、肺炎、脑膜炎、肝脓肿和败血症等。目前常用的检测无乳链球菌的方法是CAMP法，在血琼脂平板上，先以β-溶血的金黄色葡萄球菌划一横线接种。再将被检查部位所取出的培养液中的待检菌与前一划线作垂直接种，两者应相距1cm，于35℃孵育18-24h，观察结果。在两种细菌划线交接处出现箭头型溶血区为阳性。该检测方法所需成本较低，操作简单的优势，但是检测所需的工作量较大，且不同培养基影响较大，灵敏度较低，容易出现假阳性情况。临床上也用免疫层析的方法检测无乳链球菌，其优点在于检测时间短，只需10分钟即可出结果，其缺点在于特异性较低，检测结果容易受到不同样本类型的干扰，且成本较高，需要使用特殊的专业设备。荧光定量PCR方法检测无乳链球菌已经用在了临床，但是其对样本要求较高，且机器较贵，也需要专业的PCR实验室才可以开展，对操作人员的技能要求较高，不利于大范围内推广。因此，无乳链球菌的临床检测，迫切需要一种特异性高，灵敏度强的操作相对简单的低成本的试剂盒。
技术实现思路
为了克服现有技术的不足，本专利技术的目的之一在于提供一种无乳链球菌检测方法，该检测方法具有较高的特异性，检测无乳链球菌的精确度高、结果灵敏。本专利技术的目的之二在于提供无乳链球菌检测试验盒。本专利技术的目的之一采用如下技术方案实现：一种无乳链球菌检测方法，其特征在于，包括以下步骤：1)选取无乳链球菌特异性DNA序列片段140-160bp，设计引物序列和探针序列：包括设计上游引物、下游引物、一号探针和二号探针；上游引物的序列如SEQIDNo.1所示；下游引物的序列如SEQIDNo.2所示：一号探针为生物素标记探针，二号探针为氨基修饰探针且与磁珠连接；2)使用上游引物和下游引物PCR扩增DNA并用核酸外切酶酶切，得到酶切产物：3)向步骤2)的酶切产物中，加入吖啶酯溶液和一号探针的反应液，杂交，得到一次杂交产物；4)向步骤3)的一次杂交产物中，加入二号探针，反应后并于冰上冷却，在磁力架上使用清洗液将多余的吖啶酯溶液和一号探针的反应液洗去；得到二次杂交产物；5)向二次杂交产物中加入激发液，检测光信号值：所述激发液为含有过氧化氢的NaOH溶液。本申请的引物与常规的引物相比，是其所处的特异性序列片断长度约140-160bp，特异性可高达99.9％，从而使得本反应体系所带来的临床检测结果灵敏度大大提高。进一步地，步骤1)中，所述下游引物的5’端连接有Phos磷酸基团，使得其PCR扩增产物便于被酶切成单链序列。进一步地，步骤1)中，所述一号探针序列如SEQIDNo.3所示。一号探针可与发光标记物吖啶酯进行反应，得到吖啶酯和一号探针的反应液。进一步地，步骤1)中，所述一号探针的3’端连接有生物素。进一步地，步骤1)中，所述二号探针的序列如SEQIDNo.4所示。进一步地，步骤1)中，所述二号探针的5’端使用氨基修饰。进一步地，步骤2)中，所述外切酶为Lambda外切酶。进一步地，步骤3)中，所述吖啶酯溶液和一号探针的反应液由以下步骤制得：取一号探针，溶于NaHCO3，定容，得到一号探针溶液；用无水的DMSO稀释吖啶酯至其浓度是0.5±0.1μM/mL，吖啶酯DMSO溶液；将一号探针溶液和吖啶酯DMSO溶液按1：7-9的质量比混合，室温下反应4-6小时，然后用乙醇法纯化，得到吖啶酯溶液和一号探针的反应液。进一步地，步骤5)向二次杂交产物中加入激发液，检测光信号值。进一步地，所述激发液为含有0.06wt％的过氧化氢的0.2M的NaOH溶液。本专利技术的目的之二采用如下技术方案实现：一种无乳链球菌检测，包括以下组分：如SEQIDNo.1所示的上游引物；如SEQIDNo.2所示的下游引物；如SEQIDNo.3所示的一号探针，一号探针连接生物素标记；如SEQIDNo.4所示的二号探针，二号探针为氨基修饰探针且与磁珠连接。或进一步地，还包括吖啶酯DMSO溶液、清洗液和激发液，其中吖啶酯DMSO溶液中，吖啶酯的浓度为0.5±0.1μM/mL；清洗液由100μL的1Mtris溶液、100μL的5％土温-20和补足10mL的超纯水组成；所述激发液为含有0.06wt％的过氧化氢的0.2M的NaOH溶液。本专利技术的原理如下：本专利技术的无乳链球菌检测方法，通过特异性引物能有效扩增无乳链球菌DNA序列，得到双链PCR产物，使用外切酶酶切，得到酶切产物。酶切产物与吖啶酯一号探针的反应液进行杂交后的产物与二号探针再次杂交，得到二次杂交产物，在磁力架上通过磁力吸附二次杂交产物，将多余的吖啶酯一号探针的反应液洗去，消除多余吖啶酯对光信号的干扰，以便于定量检测一次杂交产物含量，再通过光检测器检测二次杂交产物的光信号值，即可得到光信号值和临床样本中目的核酸含量的关系。相比现有技术，本专利技术的有益效果在于：本专利技术的无乳链球菌检测方法，通过特异性扩增的方式，可有效识别无乳链球菌，在检测时特异性高，有效地将无乳链球菌与其它杂菌区分开来；本专利技术提供的无乳链球菌检测方法，通过光信号检测的方式，能有效使光信号值与临床样本DNA的含量具有较佳的线性关系，可以用于定量检测无乳链球菌；本专利技术的无乳链球菌检测方法，磁珠通过磁力吸附的方式，可以实现自动化检测，提高了检测效率，降低了人工成本。本专利技术可以实现对无乳链球菌的快速检测，具有高灵敏度高特异性的特点，成本低，操作简单，可以在基层医疗机构广泛开展，具有很大的市场前景。附图说明图1为核酸外切酶酶切产物鉴定；其中，M为Marker，1为酶切后的产物，2为PCR扩增产物；图2为光信号值与样本DNA含量的工作曲线。具体实施方式下面，结合具体实施方式，对本专利技术做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。本专利技术提供一种无乳链球菌检测方法，包括以下步骤：1)选取无乳链球菌特异性DNA序列片段140-160bp，设计引物序列和探针序列：包括设计上游引物、下游引物、一号探针和二号探针；上游引物的序列如SEQIDNo.1所示；下游引物的序列本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种无乳链球菌检测方法，其特征在于，包括以下步骤：/n1)选取无乳链球菌特异性DNA序列片段140-160bp，设计引物序列和探针序列：/n包括设计上游引物、下游引物、一号探针和二号探针；/n上游引物的序列如SEQ ID No.1所示；下游引物的序列如SEQ ID No.2所示：/n一号探针为生物素标记探针，二号探针为氨基修饰探针且与磁珠连接；/n2)使用上游引物和下游引物PCR扩增DNA并用核酸外切酶酶切，得到酶切产物：/n3)向步骤2)的酶切产物中，加入吖啶酯溶液和一号探针的反应液，杂交，得到一次杂交产物；/n4)向步骤3)的一次杂交产物中，加入二号探针，反应后并于冰上冷却，在磁力架上使用清洗液将多余的吖啶酯溶液和一号探针的反应液洗去；得到二次杂交产物；/n5)向二次杂交产物中加入激发液，检测光信号值：所述激发液为含有过氧化氢的NaOH溶液。/n

【技术特征摘要】
1.一种无乳链球菌检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)选取无乳链球菌特异性DNA序列片段140-160bp，设计引物序列和探针序列：
包括设计上游引物、下游引物、一号探针和二号探针；
上游引物的序列如SEQIDNo.1所示；下游引物的序列如SEQIDNo.2所示：
一号探针为生物素标记探针，二号探针为氨基修饰探针且与磁珠连接；
2)使用上游引物和下游引物PCR扩增DNA并用核酸外切酶酶切，得到酶切产物：
3)向步骤2)的酶切产物中，加入吖啶酯溶液和一号探针的反应液，杂交，得到一次杂交产物；
4)向步骤3)的一次杂交产物中，加入二号探针，反应后并于冰上冷却，在磁力架上使用清洗液将多余的吖啶酯溶液和一号探针的反应液洗去；得到二次杂交产物；
5)向二次杂交产物中加入激发液，检测光信号值：所述激发液为含有过氧化氢的NaOH溶液。


2.如权利要求1所述的无乳链球菌检测方法，其特征在于，步骤1)中，所述下游引物的5’端连接有Phos磷酸基团。


3.如权利要求1所述的无乳链球菌检测方法，其特征在于，步骤1)中，所述一号探针序列如SEQIDNo.3所示。


4.如权利要求3所述的无乳链球菌检测方法，其特征在于，步骤1)中，所述一号探针的3’端连接有生物素。


5.如权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：不公告发明人，
申请(专利权)人：广州中科抗体生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44