一种桑黄子实体抗癌活性核苷类化合物PBN2的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种桑黄子实体抗癌活性核苷类化合物PBN2的制备方法。将桑黄子实体处理获得桑黄子实体粉，加入乙醇溶液超声处理，再进行水浴回流和抽滤处理，离心收集上清液，浓缩后冷冻干燥；用双蒸馏水溶解，离心取上清液，过滤膜后上大孔吸附树脂柱吸附，乙醇溶液洗脱后取洗脱峰的洗脱液，浓缩并冷冻干燥；双蒸馏水溶解，离心取上清液，过滤膜后上阳离子交换柱，NaCl水溶液梯度洗脱，取中间洗脱峰的洗脱液，再用大孔吸附树脂柱脱盐，浓缩并冷冻干燥后得均一的核苷类化合物PBN2。本发明专利技术制备产物纯度均一，对人胃癌细胞和人胃腺癌细胞的生长均有抑制作用，对正常细胞的人胚胎肾细胞生长无不良影响，可用于抗癌产品开发。

Preparation of PbN2, an anticancer nucleoside compound of Morus igniarius

【技术实现步骤摘要】
一种桑黄子实体抗癌活性核苷类化合物PBN2的制备方法
本专利技术涉及了一种抗癌活性新化合物及制备方法，尤其是涉及了一种桑黄子实体抗癌活性核苷类化合物PBN2的制备方法。
技术介绍
核苷类化合物是生物细胞维持生命活动的基本物质，包括核苷、碱基及核苷类似物，具有抗病毒、抗氧化、抗菌、抗疲劳、提高人体免疫力、抗癌等生理活性，现已被广泛应用于抗癌、抗病毒、疾病诊断等方面。目前用于临床和正在研究的核苷类抗癌药物有数十种，它们主要是通过干扰癌细胞的DNA合成或者核酸转录的过程，来抑制蛋白质的合成，从而达到治疗癌症的效果，展示出了不可取代的独特作用。当前核苷类抗癌药物主要来源于化学合成和从天然中药材中提取分离这二个方面，化学合成存在步骤复杂、异构体不好分离、转化率低、成本高、污染环境等问题。因此，从天然中药材中筛选抗癌活性核苷类化合物，深受国内外研究者的高度关注。桑黄(Phellinusbaumii)是一种具有多种药理作用的真菌子实体，因寄生于桑树而得名，中医认为其能利五脏、软坚、排毒、止血等。现代药理学研究发现桑黄的抗癌效果极其显著，有“森林黄金”的美誉。核苷类化合物是桑黄的重要活性成分之一，但有关桑黄核苷类化合物及其抗癌作用机理还不清楚，这阻害了桑黄药用水平提高及药用范围扩大。分离纯化制备桑黄抗癌活性核苷类化合物，对于推进桑黄药用开发具有积极的现实意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种桑黄子实体抗癌活性核苷类化合物PBN2的制备方法，是采用回流提取、NKA-Ⅱ型大孔吸附树脂柱分离、SP-SepharoseFastFlow阳离子交换柱纯化的方法，制备桑黄子实体抗癌活性核苷类化合物PBN2。为了达到上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：一、一种桑黄子实体抗癌活性核苷类化合物PBN2的制备方法：1)将桑黄子实体处理获得桑黄子实体粉；2)取桑黄子实体粉加入乙醇溶液并进行超声处理；3)超声处理后的溶液依次进行水浴回流和抽滤处理，然后离心处理收集上清液；4)上清液浓缩后冷冻干燥，得到粗核苷类化合物；5)用双蒸馏水将粗核苷类化合物溶解，离心取上清液后，过滤膜再上NKA-Ⅱ型大孔吸附树脂柱吸附处理；6)用乙醇溶液洗脱后收集洗脱峰的洗脱液，浓缩并冷冻干燥后得到核苷类化合物干燥物；7)用双蒸馏水将核苷类化合物干燥物溶解，离心取上清液后，过滤膜再上SP-SepharoseFastFlow阳离子交换柱，用NaCl水溶液进行梯度洗脱，收集0.3mol/LNaCl洗脱峰的洗脱液；8)洗脱液浓缩并冷冻干燥，用双蒸馏水溶解，过滤膜再上NKA-Ⅱ型大孔吸附树脂柱脱盐；9)用乙醇溶液洗脱后收集洗脱峰的洗脱液，冷冻干燥后得到均一的核苷类化合物，取名PBN2。方法工艺条件具体为：1)桑黄子实体于-50℃下真空干燥36h，于-15℃下超微粉碎5min，过80～100目筛，得到桑黄子实体粉；2)取桑黄子实体粉，加入乙醇溶液，混匀后，在30℃下用超声波清洗仪以500W功率53KHz频率的超声波磁场作用30min；3)于100℃水浴中回流提取3次，共1.5h，集中收集三次的提取液，三次提取液经过合并后用抽滤机进行抽滤处理，弃掉滤渣，将滤液用高速离心机于10000rpm下离心5min，弃掉沉淀，收集上清液；4)上清液用旋转蒸发仪浓缩后，-50℃下真空干燥，得到粗核苷类化合物；5)用双蒸馏水溶解粗核苷类化合物并调整质量浓度为5.0～6.0mg/mL，将溶液在8000rpm下离心10min，取上清液，过0.45μm滤膜，上NKA-Ⅱ型大孔吸附树脂柱吸附，用5倍柱体积的去离子水充分冲洗；6)用质量分数为75％的乙醇溶液于2.0～3.0mL/min流速下洗脱，自动收集器收集，用紫外分光光度计于254nm波长测定，收集合并具有核苷类化合物洗脱峰的洗脱液，用旋转蒸发仪浓缩后，-50℃下真空干燥，得到核苷类化合物干燥物；7)用双蒸馏水溶解核苷类化合物干燥物并调整质量浓度为2.0～2.5mg/mL，将溶液在8000rpm下离心10min，取上清液，过0.45μm滤膜，上SP-SepharoseFastFlow阳离子交换柱，用0-0.5mol/L浓度梯度的NaCl水溶液进行梯度洗脱，洗脱流速为1.0-1.3mL/min，收集0.3mol/LNaCl洗脱峰的洗脱液；8)洗脱液用旋转蒸发仪浓缩后，-50℃下真空干燥，用双蒸馏水溶解干燥物并调整质量浓度为2.5～3.0mg/mL，将溶液在8000rpm下离心10min，取上清液，过0.45μm滤膜，上NKA-Ⅱ型大孔吸附树脂柱吸附，用5倍柱体积的去离子水充分冲洗；9)用质量分数为75％的乙醇溶液于2.0～3.0mL/min流速下洗脱，自动收集器收集，用紫外分光光度计于254nm波长测定，收集合并具有核苷类化合物洗脱峰的洗脱液，用旋转蒸发仪浓缩后，-50℃下真空干燥，得到均一的核苷类化合物，取名PBN2。所述步骤2)中，按W：V为1:50配比加入桑黄子实体粉和质量分数为82％的乙醇溶液。二、由上述方法制备而成的桑黄子实体抗癌活性核苷类化合物PBN2在抗癌和制备抗癌药物中的应用。所述抗癌中的应用是针对人胃癌细胞SGC-7901和人胃腺癌细胞AGS，具体是抑制癌细胞生长的作用。本专利技术具有的有益效果是：本专利技术分离纯化制备的桑黄子实体抗癌活性核苷类化合物PBN2，纯度均一，对人胃癌细胞SGC-7901和人胃腺癌细胞AGS的生长均表现出明显的抑制作用，对正常细胞的人胚胎肾细胞HEK293生长无不良影响，可用于抗癌产品的开发，这对于提升桑黄药用价值，具有积极的社会效益和经济效益。具体实施方式下面结合附表和实施例对本专利技术作进一步说明。实施之前，先将桑黄子实体于-50℃下真空干燥36h，于-15℃下超微粉碎5min，过80～100目筛，得到桑黄子实体粉，用于以下各个实施例。本专利技术实施例采用MTT法检测PBN2对人胃癌细胞SGC-7901、人胃腺癌细胞AGS和正常细胞的人胚胎肾细胞HEK293的生长情况影响，来验证本专利技术制备产物是否具有其技术效果。实施例1：取过90目筛的桑黄子实体粉，按1:50料液比加入质量分数为82％的乙醇溶液，混匀后，在30℃下用超声波清洗仪以500W功率53KHz频率的超声波磁场作用30min。于100℃水浴中回流提取3次，共1.5h，集中收集三次的提取液，三次提取液经过合并后用抽滤机进行抽滤处理，弃掉滤渣，将滤液用高速离心机于10000rpm下离心5min，弃掉沉淀，收集上清液。上清液用旋转蒸发仪浓缩，-50℃下真空干燥，得到粗核苷类化合物。用双蒸馏水溶解粗核苷类化合物并调整质量浓度为5.5mg/mL，将溶液在8000rpm下离心10min，取上清液，过0.45μm滤膜，上NKA-Ⅱ型大孔吸附树脂柱吸附，用5倍柱体积的去离子水充分冲洗。用质量分数为本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种桑黄子实体抗癌活性核苷类化合物PBN2的制备方法，其特征在于：/n1)将桑黄子实体处理获得桑黄子实体粉；/n2)取桑黄子实体粉加入乙醇溶液并进行超声处理；/n3)超声处理后的溶液依次进行水浴回流和抽滤处理，然后离心处理收集上清液；/n4)上清液浓缩后冷冻干燥，得到粗核苷类化合物；/n5)用双蒸馏水将粗核苷类化合物溶解，离心取上清液后，过滤膜再上NKA-Ⅱ型大孔吸附树脂柱吸附处理；/n6)用乙醇溶液洗脱后收集洗脱峰的洗脱液，浓缩并冷冻干燥后得到核苷类化合物干燥物；/n7)用双蒸馏水将核苷类化合物干燥物溶解，离心取上清液后，过滤膜再上SP-Sepharose Fast Flow阳离子交换柱，用NaCl水溶液进行梯度洗脱，收集0.3mol/L NaCl洗脱峰的洗脱液；/n8)洗脱液浓缩并冷冻干燥，用双蒸馏水溶解，过滤膜再上NKA-Ⅱ型大孔吸附树脂柱脱盐；/n9)用乙醇溶液洗脱后收集洗脱峰的洗脱液，冷冻干燥后得到均一的核苷类化合物，取名PBN2。/n

【技术特征摘要】
1.一种桑黄子实体抗癌活性核苷类化合物PBN2的制备方法，其特征在于：
1)将桑黄子实体处理获得桑黄子实体粉；
2)取桑黄子实体粉加入乙醇溶液并进行超声处理；
3)超声处理后的溶液依次进行水浴回流和抽滤处理，然后离心处理收集上清液；
4)上清液浓缩后冷冻干燥，得到粗核苷类化合物；
5)用双蒸馏水将粗核苷类化合物溶解，离心取上清液后，过滤膜再上NKA-Ⅱ型大孔吸附树脂柱吸附处理；
6)用乙醇溶液洗脱后收集洗脱峰的洗脱液，浓缩并冷冻干燥后得到核苷类化合物干燥物；
7)用双蒸馏水将核苷类化合物干燥物溶解，离心取上清液后，过滤膜再上SP-SepharoseFastFlow阳离子交换柱，用NaCl水溶液进行梯度洗脱，收集0.3mol/LNaCl洗脱峰的洗脱液；
8)洗脱液浓缩并冷冻干燥，用双蒸馏水溶解，过滤膜再上NKA-Ⅱ型大孔吸附树脂柱脱盐；
9)用乙醇溶液洗脱后收集洗脱峰的洗脱液，冷冻干燥后得到均一的核苷类化合物，取名PBN2。


2.根据权利要求1所述的一种桑黄子实体抗癌活性核苷类化合物PBN2的制备方法，其特征在于方法的工艺条件具体为：
1)桑黄子实体于-50℃下真空干燥36h，于-15℃下超微粉碎5min，过80～100目筛，得到桑黄子实体粉；
2)取桑黄子实体粉，加入乙醇溶液，混匀后，在30℃下用超声波清洗仪以500W功率53KHz频率的超声波磁场作用30min；
3)于100℃水浴中回流提取3次，共1.5h，集中收集三次的提取液，三次提取液经过合并后用抽滤机进行抽滤处理，弃掉滤渣，将滤液用高速离心机于10000rpm下离心5min，弃掉沉淀，收集上清液；
4)上清液用旋转蒸发仪浓缩后，-50℃下真空干燥，得到粗核苷类化合物；
5)用双蒸馏水溶解粗核苷类化合物并调整质量浓度为5.0～6.0mg/mL，将溶液在8000rpm下离心10min，取上清液，过0.45μ...

【专利技术属性】
技术研发人员：时连根，崔诗遥，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33