一种农杆菌介导的菊花转染体系的构建方法及其应用技术

本发明专利技术提供了一种农杆菌介导的菊花转染体系的构建方法及其应用，涉及遗传转化技术领域，通过研究农杆菌转化时所涉及到的各项影响条件，包括培养基种类、激素种类及浓度、菌液浓度、侵染时间、侵染条件、共培养时间、抗生素浓度等，提供了一套适合菊花的农杆菌介导转化体系，提高转化率，获得更多的阳性转基因植株。利用本发明专利技术的构建方法，利用愈伤组织获得再生植株，再生率为90～95％；经PCR检测，转基因阳性率为70～90％，可用于获得难以通过传统育种方式生产的菊花新品种。

Construction and application of an Agrobacterium mediated chrysanthemum transfection system

【技术实现步骤摘要】
一种农杆菌介导的菊花转染体系的构建方法及其应用
本专利技术属于遗传转化
，具体涉及一种农杆菌介导的菊花转染体系的构建方法及其应用。
技术介绍
菊花(Chrysanthemummorifolium)起源于我国，有着3000多年的悠久历史，因其丰富的形态，艳丽的色彩和悠久的文化而深受人们的喜爱。菊花不但有观赏性，还有较高的食用及药用价值，多数的菊花品种还具有抗菌消炎、清热明目的作用，在我国古代医书中就有很多关于菊花入药的记录。观赏、药用及食用价值给菊花带来越来越高的经济价值，为了满足消费者的需要，菊花的种质资源不断丰富，不同花色、花型、花期的菊花不断上市，菊花的销售市场越来越活跃。但蓝色花色的菊花依然是空白，培养蓝色的转基因菊花新品种是近年来菊花育种的目标。农杆菌介导的植物基因转化系统目前广泛应用于植物基因工程研究，在菊花的遗传转化中最大的难题是转化效率低：如在“农杆菌介导CBL基因对菊花品种‘C008’的转化(西北林学院学报，2017，32(1):184-189)”一文中介绍以菊花品种‘C008’无菌苗叶片作为外植体进行转化，最终转本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种农杆菌介导的菊花转染体系的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)以菊花无菌苗茎段为外植体，在预培养基中诱导培养4～7d，得愈伤组织；所述预培养基以B5培养基为基本培养基，还包括：2～3mg/L6-BA、0.5～1.0mg/L IAA、30～40g/L蔗糖和9～12g/L琼脂，pH 5.8～6.2；/n(2)将农杆菌接种到含有50mg/L利福平的YEB培养基中，于28℃，180rpm条件下振荡培养24h后，将得到的菌液接种到新鲜的YEB培养基中，于28℃下，180rpm条件下振荡培养至OD

【技术特征摘要】
1.一种农杆菌介导的菊花转染体系的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)以菊花无菌苗茎段为外植体，在预培养基中诱导培养4～7d，得愈伤组织；所述预培养基以B5培养基为基本培养基，还包括：2～3mg/L6-BA、0.5～1.0mg/LIAA、30～40g/L蔗糖和9～12g/L琼脂，pH5.8～6.2；
(2)将农杆菌接种到含有50mg/L利福平的YEB培养基中，于28℃，180rpm条件下振荡培养24h后，将得到的菌液接种到新鲜的YEB培养基中，于28℃下，180rpm条件下振荡培养至OD600为0.6～0.8，得农杆菌菌液；所述农杆菌中含有目的基因和筛选基因质粒；
(3)将乙酰丁香酮与所述愈伤组织和农杆菌菌液混合侵染8～20min，得侵染愈伤组织；
(4)将所述侵染愈伤组织接种于共培养培养基中进行共培养，得共培养愈伤组织；所述共培养培养基以B5培养基为基本培养基，还包括：2～3mg/L6-BA、0.5～1.0mg/LIAA、30～40g/L蔗糖、9～12g/L琼脂和100～200μmol/L乙酰丁香酮，pH5.8～6.2；
(5)将所述共培养愈伤组织接种至筛选培养基中进行筛选分化培养，得不定芽；所述筛选培养基以B5培养基为基本培养基，还包括：2～3mg/L6-BA、0.5～1.0mg/LIAA、30～40g/L蔗糖、9～12g/L琼脂、200～400mg/L羧苄青霉素和20～40mg/L潮霉素，pH5.8～6.2；
(6)将所述不定芽接种于扩繁培养基中进行扩繁培养，得转基因菊花；所述扩繁培养基以B5培养基为基本培养基，还包括：0.3～0.5mg/L6...

【专利技术属性】
技术研发人员：周旭红，杨晓密，叶世隆，李姝影，曹磊，毛羽，罗柯佳，
申请(专利权)人：云南中医药大学，
类型：发明
国别省市：云南;53