一种驴骨胶特征性多肽及其在检测动物皮胶及其制品中驴骨胶成分中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种驴骨胶特征性多肽及其在检测动物皮胶及其制品中驴骨胶成分中的应用。所述的驴骨胶特征性多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，该多肽为驴骨胶特有，而阿胶、黄明胶、猪皮胶等动物皮胶则不含。通过液质联用仪对该多肽进行检测，实现了对动物皮胶及其制品中驴骨胶成分的快速鉴别检测，而且还可以对驴骨胶成分进行准确定量。本发明专利技术的方法特征性强，灵敏度高，操作简单，为检测动物皮胶及其制品中驴骨胶成分的检测提供了有效技术手段。

A characteristic polypeptide of donkey bone glue and its application in the detection of donkey bone glue in animal skin glue and its products

【技术实现步骤摘要】
一种驴骨胶特征性多肽及其在检测动物皮胶及其制品中驴骨胶成分中的应用
本专利技术涉一种驴骨胶特征性多肽及其应用，还涉及动物皮胶及其制品中驴骨胶成分的检测方法，本专利技术属于医药与食品检测

技术介绍
动物胶为由动物的皮、骨等熬制而成胶类物质，在食品、保健品和药品中有着广泛的应用。动物皮胶常见的包括阿胶、黄明胶、猪皮胶等，在临床应用上各有特点，需用规定原料熬制，比如阿胶由驴皮熬制、黄明胶由牛皮熬制等，否则将视为伪品。因各种胶外观非常相似，而且价格差别很大，因此除了各种胶容易混淆外，市场上还出现了造假、制假的不法分子。以阿胶为例，在生产阿胶时，部分用其他动物皮包括马皮、牛皮、猪皮等，也有用驴骨来取代驴皮进行假阿胶的熬制，从而谋取非法利益。随着质谱检测技术的发展，逐渐产生了动物皮类样品中驴、马、牛、猪、羊源性成分的检测方法，它们都是基于不同动物的Ⅰ型胶原蛋白中氨基酸序列的不同，寻找特征性多肽进行检测。但是对于动物皮胶与骨胶的鉴别区分仍存在很大困难，比如阿胶与驴骨胶，它们的成分相近，Ⅰ型胶原蛋白序列相同，因此无法采用以前的方法进行鉴别区分。因此，迫切需要提出一种能够快速、准确检测动物皮胶及其制品中驴骨胶含量的方法，进而实现对动物皮胶及其制品，尤其是阿胶产品的真伪鉴别。
技术实现思路
本专利技术的主要目的就是针对以上存在的问题，提供一种驴骨胶特征性多肽，并建立针对动物皮胶及其制品中驴骨胶成分的检测方法，该方法操作简单，灵敏度高，不但能鉴定是否含有驴骨胶成分，而且还能准确定量。<br>为了实现上述目的，本专利技术采用了如下技术方案：首先，本专利技术提出了一种驴骨胶特征性多肽，所述的驴骨胶特征性多肽的氨基酸序列为Gly-Glu-Hyp-Gly-Gly-Ala-Gly-Pro-Val-Gly-Pro-Hyp-Gly-Glu-Arg(SEQIDNO.1所示，其中Xaa＝Hyp)。进一步的，本专利技术还提出了所述的驴骨胶特征性多肽在检测动物皮胶及其制品中驴骨胶成分中的应用。其中，优选的，本专利技术通过液质联用仪对所述的骨胶特征性多肽进行检测，进而来判定动物皮胶及其制品中是否含有驴骨胶成分。更进一步的，本专利技术还提出了一种检测动物皮胶及其制品中驴骨胶成分的方法，当检测样品为动物皮胶时，包括以下步骤：将待测的动物皮胶用胰蛋白酶进行酶切处理后，取酶解液注入液质联用仪，采用二级质谱模式，选择m/z683.7(双电荷)→590.5，m/z683.7(双电荷)→628.5，m/z683.7(双电荷)→826.4作为检测离子对进行MRM检测，对照品为驴骨胶纯品或是以待检测的阴性样品为基质，通过加入上述的驴骨胶特征性多肽制备而成；如果检测出的该离子的保留时间与对照品一致，而且其子离子与对照品的子离子一致，则所述样品中含有驴骨胶成分，其含量可根据对照品的峰面积计算。当检测样品为动物皮胶制品时，包括以下步骤：将待测的动物皮胶制品经蛋白提纯后，用胰蛋白酶进行酶切处理，取酶解液注入液质联用仪，采用二级质谱模式，选择m/z683.7(双电荷)→590.5，m/z683.7(双电荷)→628.5，m/z683.7(双电荷)→826.4作为检测离子对进行MRM检测，对照品为驴骨胶纯品或是以待检测的阴性样品为基质，通过加入上述的驴骨胶特征性多肽制备而成；如果检测出的该离子的保留时间与对照品一致，而且其子离子与对照品的子离子一致，则所述样品中含有驴骨胶成分，其含量可根据对照品的峰面积计算。其中，优选的，将待测的动物皮胶用胰蛋白酶进行酶切处理的具体操作步骤为：取0.05g待测动物皮胶样品于25ml量瓶中，用1％w/vNH4HCO3溶液(pH8.0)溶解并定容，过0.22μm微孔滤膜，精密量取续滤液300μl，加2mg/ml的胰蛋白酶溶液30μl，37℃恒温酶解过夜，获得酶解液。其中，优选的，动物皮胶制品进行蛋白提纯以及酶切处理的具体操作为：取0.5g待测动物皮胶制品于50ml量瓶中，加适量水，超声使样品溶解完全，用水定容至刻度，取5ml加入5ml的30％v/v的三氯乙酸溶液，4℃静置30min，然后5000rpm离心5min，弃清液，沉淀物中加5ml丙酮，振荡5min，5000rpm离心5min，弃清液，沉淀物在室温下干燥15min，移入25ml量瓶中，用1％w/vNH4HCO3溶液(pH8.0)溶解并定容，过0.22μm微孔滤膜，精密量取续滤液300μl，加2mg/ml的胰蛋白酶溶液30μl，37℃恒温酶解过夜，获得酶解液。其中，优选的，液质联用仪的检测条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以0.1％v/v甲酸溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，梯度洗脱：0～25min，A95％→80％，B5％→20％。流速为0.3ml/min。以质谱仪作为检测器，电喷雾离子源(ESI+)。其中，优选的，所述动物皮胶包括阿胶、黄明胶、猪皮胶。其中，优选的，所述动物皮胶制品包括由动物皮胶制成的食品、保健品或药品。相较于现有技术，本专利技术的有益效果是：本专利技术提出了一种驴骨胶特征性多肽(Gly-Glu-Hyp-Gly-Gly-Ala-Gly-Pro-Val-Gly-Pro-Hyp-Gly-Glu-Arg)，该多肽为驴骨胶特有，而阿胶、黄明胶、猪皮胶等动物皮胶则不含，基于该驴骨胶特征性多肽，本专利技术选择m/z683.7(双电荷)→590.5，m/z683.7(双电荷)→628.5，m/z683.7(双电荷)→826.4作为检测离子对，其中选择m/z683.7→590.5作为定量离子对，通过液质联用仪对该多肽进行检测，实现了对动物皮胶及其制品中驴骨胶成分的快速鉴别检测，而且还可以对驴骨胶成分进行准确定量。本专利技术的方法特征性强，灵敏度高，操作简单，为检测动物皮胶及其制品中驴骨胶成分的检测提供了有效技术手段。附图说明为了使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本专利技术作进一步的详细描述，其中：图1是四种纯品胶MRM扫描模式下选择离子对m/z683.7→590.5，628.5，826.4监测的质谱图；图2是加入5％驴骨胶的混合胶MRM扫描模式下选择离子对m/z683.7→590.5，628.5，826.4监测的质谱图；图3是不同浓度驴骨胶的混合胶MRM扫描模式下选择离子对m/z683.7→590.5监测的质谱图；图4是阿胶制品(以阿胶补血膏为例)在MRM扫描模式下选择离子对m/z683.7→590.5，628.5，826.4监测的质谱图。具体实施方式以下将参照附图，对本专利技术的优选实例进行详细描述。优选实例中没有注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或制造厂商所建议的条件进行。实施例11材料和试剂待测样品：各种纯品胶，包括驴骨胶、阿胶、黄明胶、猪皮胶，分别用驴骨、驴皮、牛皮、猪皮煎煮获得。试剂：碳酸氢铵(分析纯)、胰蛋白酶(序列纯，购自中国药品生物制品检定研究院)。2本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种驴骨胶特征性多肽，其特征在于，所述的驴骨胶特征性多肽的氨基酸序列为Gly-Glu-Hyp-Gly-Gly-Ala-Gly-Pro-Val-Gly-Pro-Hyp-Gly-Glu-Arg。/n

【技术特征摘要】
1.一种驴骨胶特征性多肽，其特征在于，所述的驴骨胶特征性多肽的氨基酸序列为Gly-Glu-Hyp-Gly-Gly-Ala-Gly-Pro-Val-Gly-Pro-Hyp-Gly-Glu-Arg。


2.权利要求1所述的驴骨胶特征性多肽在检测动物皮胶及其制品中驴骨胶成分中的应用。


3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，通过液质联用仪对所述的骨胶特征性多肽进行检测，进而来判定动物皮胶及其制品中是否含有驴骨胶成分。


4.一种检测动物皮胶及其制品中驴骨胶成分的方法，其特征在于，当检测样品为动物皮胶时，包括以下步骤：
将待测的动物皮胶用胰蛋白酶进行酶切处理后，取酶解液注入液质联用仪，采用二级质谱模式，选择m/z683.7(双电荷)→590.5，m/z683.7(双电荷)→628.5，m/z683.7(双电荷)→826.4作为检测离子对，选择m/z683.7→590.5作为定量离子对进行MRM检测，对照品为驴骨胶纯品或是以待检测的阴性样品为基质，通过加入权利要求1所述的驴骨胶特征性多肽制备而成；如果检测出的该离子的保留时间与对照品一致，而且其子离子与对照品的子离子一致，则所述样品中含有驴骨胶成分，其含量可根据对照品的峰面积计算；
当检测样品为动物皮胶制品时，包括以下步骤：
将待测的动物皮胶制品经蛋白提纯后，用胰蛋白酶进行酶切处理，取酶解液注入液质联用仪，采用二级质谱模式，选择m/z683.7(双电荷)→590.5，m/z683.7(双电荷)→628.5，m/z683.7(双电荷)→826.4作为检测离子对，选择m/z683.7→590.5作为定量离子对进行MRM检测，对照品为驴骨胶纯品或是以待检测的阴性样品为基质，通过加入权利要求1所述的驴骨胶特征性多肽制备而成；如果检测出的该离子的保留时间...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭尚伟，段小波，周祥山，田守生，徐云鹏，王雨华，王玉娇，史兆松，
申请(专利权)人：东阿阿胶股份有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37