一种提高水溶性藻青素外源合成产量的方法技术

本发明专利技术公开了一种提高水溶性藻青素外源合成产量的方法，属于生物基因工程、微生物发酵技术领域。该方法以TB培养基为对照，依据大肠杆菌诱导表达载体系统，使藻青素合成酶合成藻青素，选用特定的培养基组分和培养温度，使得水溶性藻青素合成产量获得大幅提高本发明专利技术生产的水溶性藻青素，具有比对照培养产生的水溶性藻青素产量高2.2倍的特性，为水溶性藻青素生产提供了更高效的培养条件。

A method to increase the yield of exogenous synthesis of water soluble phycocyanin

【技术实现步骤摘要】
一种提高水溶性藻青素外源合成产量的方法
本专利技术涉及生物基因工程、微生物发酵
，特别是指一种可提高水溶性藻青素外源合成产量的方法及其应用。
技术介绍
藻青素(CGP)是一种非核糖体合成的氨基酸聚合物，存在于大多数蓝藻细菌和一些异养细菌中。它包括一个聚L天冬氨酸(Asp)主链，众多精氨酸(Arg)通过其氨基连接到每个天冬氨酸的羧基上形成的侧链。Arg和Asp通常以等摩尔量存在于聚合物中。天然的藻青素分子质量大小为25kDa到100kDa，具有广泛的多分散性。天然状态下的藻青素根据其物理性质的不同可分为两种形式：不溶性和水溶性的藻青素。可溶于中性溶液的称为水溶性藻青素，可以通过添加乙醇来使该复合物沉淀。不溶性藻青素仅溶解在pH<2.0或者pH>9.0溶液中，在中性条件下则会产生沉淀。藻青素作为氮和碳的储存化合物，被认为是大多数蓝细菌颗粒包裹体的组成部分。近年来，由于其在食品、医药、化妆品、营养、农业等领域的应用，引起了越来越多的关注。目前藻青素合成的主流趋势分为将藻青素合成酶CphA进行异源表达或者直接进行藻青素的体外合成。异源表达的主要宿主包括各种杆菌，烟草和酵母菌。其中大肠杆菌以遗传背景清楚，载体受体系统完备，生长迅速，培养简单，重组子稳定等一系列优点，被作为受体广泛研究。由于可以分解藻青素的酶也即是藻青素酶可以采用基因敲除的手段人为去除，并且在大肠杆菌中该酶的活性被抑制，这导致大量藻青素在细胞中沉积。实验表明，从外源表达系统中分离出来的藻青素与蓝细菌产生的藻青素分子量存在大小上的差异。外源表达系统中分离出来的藻青素一般水溶性藻青素约为0-25kDa，不可溶性藻青素为25-33kDa。近年来对藻青素的热稳定性和生物相容性进行了研究，藻青素的弹性压缩模量为560MPa，在200℃以下具有热稳定性。在生物相容性方面，水溶性藻青素对中国仓鼠卵巢CHO细胞无任何毒性。CHO细胞在藻青素形成的薄膜上表现出更高的细胞密度，去除含血清的培养基后，细胞形态可维持72h。这些属性无疑揭示了水溶性藻青素在生物医学上的应用前景。在2002年国外医药期刊上已由研究者祁红报道了藻青素对内毒素处理小鼠血清中TNF-α及亚硝酸盐水平的影响，2017年AhmedSallam等人发表专利Aspartyl-DipeptidesForSkinCareandCosmeticUse，专利号为US2019/0117548A1，探讨了藻青素在护肤品领域的应用。尽管藻青素合成载体广泛，研究领域众多，但由于其产量有限，目前以大肠杆菌为载体采用CphA6308基因的藻青素外源表达，水溶性藻青素产量50-100mg/g，而不溶性藻青素占菌体干重的200-300mg/g，以大肠杆菌为载体采用CphA6803基因的藻青素外源表达，水溶性藻青素产量多为菌体干重的30-50mg/g，而不溶性藻青素占菌体干重的100-200mg/g。而本专利技术采用的CphABP基因，在经过培养条件的改变后在不降低不溶性藻青素产量的情况下，可达到水溶性藻青素产量占菌体干重的160mg/g。
技术实现思路
本专利技术解决的技术问题是：提出一种可以提高水溶性藻青素异源合成产量的方法，用于克服上述现有技术中的水溶性藻青素产量低下的缺点。为了解决上述技术问题，本专利技术提出的技术方案是：一种提高水溶性藻青素外源合成产量的方法，利用重组大肠杆菌生产水溶性藻青素，将生产藻青素的大肠杆菌活化菌液接种于提高水溶性藻青素产量的发酵培养基中，在温度为35℃诱导培养30h；所述重组大肠杆菌使用的重组菌株为EscherichiacoliBL21宿主菌，所述菌株包含有pCOLADuet-1表达载体和来源于ThermosynechococcuselongatusBP-1的藻青素合成酶基因CphABP，所述基因的编号为GenBankNo：NC_004113，所述发酵培养基成分为2.4％的酵母粉、1mM的天冬氨酸和1mM的赖氨酸、4mL/L的甘油、由17mMKH2PO4和72mMK2HPO4组成的磷酸盐缓冲液。优选的，所述提高水溶性藻青素产量的培养基中，所述碳源为甘油、酵母粉、氨基酸；所述主要氮源为酵母粉；所述无机盐为磷酸盐。优选的，所述活化菌液的制备方法是重组大肠杆菌单菌落接种于LB液体培养基，在温度为37℃、转速180rpm条件下震荡培养16h，得活化菌液。优选的，将所述活化菌液与所述发酵培养基按体积比1:100接种，在温度为37℃、转速为180rpm条件下预培养2-3h，再诱导培养30h。优选的，将所述活化菌液与所述发酵培养基按体积比1:100接种，在温度为37℃、转速为180rpm条件下预培养2-3h，待菌液OD600＝0.4-0.5时，添加0.01％浓度的1M异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，在温度为35℃，转速为180rpm条件下培养30h。优选的，还包括藻青素纯化步骤，依据大肠杆菌菌体特性，收菌条件为5500rpm，离心10min；将收集的菌体烘干，并依据菌体干重10-20mL/g添加pH值为1.4的盐酸，在摇床温度为30℃，转速为140rpm条件下震荡12h，将菌体裂解液以转速9000rpm离心30分钟收集上清，沉淀再次添加5mL0.1M的盐酸，30℃摇晃1h后离心收集上清；将两次所得上清混合，添加NaOH调节pH至7.0，将中性的浑浊液以转速9000rpm离心30分钟，收集沉淀为不可溶性藻青素，上清添加2倍体积的冰乙醇后再次以转速9000rpm离心30分钟，收集沉淀为水溶性藻青素。水溶性藻青素外源合成和分析的方法，包括如下步骤：重组菌株构建，菌体活化，扩大培养，转接至特定培养基，添加诱导物，收菌纯化，产量计算，液相色谱检测。所用的CphABP基因，是仅来自ThermosynechococcuselongatusBP-1，该基因功能公布于文献AcyanophycinsynthetasefromThermosynechococcuselongatusBP-1catalyzesprimer-independentcyanophycinsynthesis，基因序列公布于GenBank公共数据库，编号为NC_004113(2249112..2251802)。将CphABP基因的DNA片段连接至质粒pCOLADuet-1上并转化至EscherichiacoliBL21宿主菌中，获得重组菌株。活化和扩大培养的方法是根据重组菌株生长和质粒pCOLADuet-1的特性，恢复重组菌株活性。其中，LB培养基包括如下成分：LB液体培养基(100mL)(M/V)：蛋白胨1.0％，酵母提取物0.5％，NaCl1.0％。菌体活化步骤包括：超净工作台无菌条件下，取甘油菌种划线于添加0.1％卡那霉素的LB固体平板，放置于37℃的恒温培养箱中，培养12h。菌体扩大培养步骤包括：挑取上述活化后的重组菌株单菌落，接种于含100mLLB液体培养基的三角烧瓶中。此外，同时需添加0.1％的卡那霉素于培养基中，培养条件为温度37℃，转速为本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种提高水溶性藻青素外源合成产量的方法，其特征在于：利用重组大肠杆菌生产水溶性藻青素，将生产藻青素的大肠杆菌活化菌液接种于提高水溶性藻青素产量的发酵培养基中，在温度为35℃诱导培养30h；所述重组大肠杆菌使用的重组菌株为Escherichiacoli BL21宿主菌，所述菌株包含有pCOLADuet-1表达载体和来源于Thermosynechococcuselongatus BP-1的藻青素合成酶基因CphA

【技术特征摘要】
1.一种提高水溶性藻青素外源合成产量的方法，其特征在于：利用重组大肠杆菌生产水溶性藻青素，将生产藻青素的大肠杆菌活化菌液接种于提高水溶性藻青素产量的发酵培养基中，在温度为35℃诱导培养30h；所述重组大肠杆菌使用的重组菌株为EscherichiacoliBL21宿主菌，所述菌株包含有pCOLADuet-1表达载体和来源于ThermosynechococcuselongatusBP-1的藻青素合成酶基因CphABP，所述基因的编号为GenBankNo：NC_004113，所述发酵培养基成分为2.4％的酵母粉、1mM的天冬氨酸和1mM的赖氨酸、4mL/L的甘油、由17mMKH2PO4和72mMK2HPO4组成的磷酸盐缓冲液。


2.根据权利要求1所述提高水溶性藻青素外源合成产量的方法，其特征在于：所述提高水溶性藻青素产量的培养基中，所述碳源为甘油、酵母粉、氨基酸；所述主要氮源为酵母粉；所述无机盐为磷酸盐。


3.根据权利要求1所述的提高水溶性藻青素外源合成产量的方法，其特征在于：所述活化菌液的制备方法是重组大肠杆菌单菌落接种于LB液体培养基，在温度为37℃、转速180rpm条件下震荡培养16h，得活化菌液。


4.根据权利要求1所述的提高水溶性藻青素外源合成产量的方法，...

【专利技术属性】
技术研发人员：林凌，陈明明，朱国萍，
申请(专利权)人：安徽师范大学，
类型：发明
国别省市：安徽;34