一种测定磷酸甘油酸激酶活性的方法技术

本发明专利技术提供一种测定磷酸甘油酸激酶活性的方法，通过测定PGK催化BPG和ADP向3‑PG和ATP正向转化的速率。本发明专利技术的正向反应更加彻底，测定的线性范围更大，反应速率更快，测定时间更短，因此相对于测定逆向反应的方法，测定正向反应可以在更加微量的样本中检测PGK的活性，具有更大的实用价值。本方法最终产生ATP，因而可以偶联荧光素酶读取ATP产生的量来测定活性，从而适应多功能酶标仪荧光检测，可以扩大样本检测通量，降低检测限。适用于检测微量样本及高通量检测。

A method for the determination of phosphoglycerate kinase activity

【技术实现步骤摘要】
一种测定磷酸甘油酸激酶活性的方法
本专利技术属技术专利技术，涉及测定磷酸甘油酸激酶活性的方法学，尤其涉及在生物样本中测定磷酸甘油酸激酶活性的方法。
技术介绍
在介绍
技术介绍
前，先引入名词和名词缩写：PGK，PhosphoglycerateKinase，磷酸甘油酸激酶；GAPDH，glyceraldehyde3-phosphatedehydrogenase,3-磷酸甘油醛脱氢酶；BPG，1,3-bisphosphoglycerate,1,3-二磷酸甘油酸；3-PG,3-phosphoglycerate,3-磷酸甘油酸；GA3-P，glyceraldehyde3-phosphate,3-磷酸甘油醛；ADP，adenosinediphosphate,二磷酸腺苷；ATP,adenosinetriphosphate，三磷酸腺苷；Pi,phosphoricacid，磷酸；NADH，Nicotinamideadeninedinucleotide，reduced,还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸；NAD+，Nicotinamideadeninedinucleotid本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种测定磷酸甘油酸激酶活性的方法，其特征在于，通过以下步骤实现：/n(1)第一步反应：向石英比色杯中加入1ml反应缓冲液，再依次加入10μL、100mM 3-磷酸甘油醛至终浓度1mM，5μL、200mM烟酰胺腺嘌呤二核苷酸至终浓度1mM，混匀溶液后，在紫外分光光度计上340nm吸光度读数归零，再加入1个酶活力单位的3-磷酸甘油醛脱氢酶，持续记录A

【技术特征摘要】
1.一种测定磷酸甘油酸激酶活性的方法，其特征在于，通过以下步骤实现：
(1)第一步反应：向石英比色杯中加入1ml反应缓冲液，再依次加入10μL、100mM3-磷酸甘油醛至终浓度1mM，5μL、200mM烟酰胺腺嘌呤二核苷酸至终浓度1mM，混匀溶液后，在紫外分光光度计上340nm吸光度读数归零，再加入1个酶活力单位的3-磷酸甘油醛脱氢酶，持续记录A340吸光度，A340读数迅速上升，当A340读数稳定时，反应达到平衡；
(2)第二步反应：第一步反应达到平衡后，加入终浓度2mM二磷酸腺苷和待测生物样本，此时会发生单向反应5：



(3)分光光度法检测：在第二步反应的同时，记录A340变化值，在340nm吸光度处检测；
(4)荧光法检测：
在第一步反应达到平衡后，加入二磷酸腺苷至终浓度2mM，混匀，将混合物加至96孔微孔板中，每孔50μL，再每孔加入50μL待测生物样本，每孔加入50μL发光溶液，然后置于多功能酶标仪检测化学发光强度，同步设置PGK酶活性标准曲线，计算样品中PGK活性；
(5)酶学活性测定：
NADH的产生速率(RNADH)通过其摩尔吸光系数，ε＝6.22×103L×mol-1×cm-1，及A340变化值计算获得，测定磷酸甘油酸激酶的初速度，根据PGK初速度计算...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡汛，金呈朦，吴昊，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33