靶向三阴性乳腺癌细胞PENK基因的miR-506及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种靶向三阴性乳腺癌细胞PENK基因的miR‑506及其应用，通过miRWalk 2.0、miRBase、TargetScanHuman 7.0数据库筛选以及qRT‑PCR技术检测三阴性乳腺癌病人组织样本，证实miR‑506在三阴性乳腺癌表达显著下降，平均下调88.95％，通过双荧光素酶报告实验证实miR‑506与Penk能直接相互作用，说明miR‑506能靶向作用于PENK。本发明专利技术证实miR‑506通过靶向提高penk的含量影响三阴性乳腺癌细胞的增殖、转移和侵袭。本发明专利技术通过裸鼠乳腺癌模型检测miR‑506靶向penk抑制三阴性乳腺癌肿瘤进展的有效性。结果表明miR‑506能通过靶向penk抑制三阴性乳腺癌肿瘤的发展。

Mir-506 targeting pink gene in three negative breast cancer cells and its application

【技术实现步骤摘要】
靶向三阴性乳腺癌细胞PENK基因的miR-506及其应用
本专利技术属于分子生物学和肿瘤学领域，具体涉及靶向三阴性乳腺癌细胞PENK基因的miR-506及其应用。
技术介绍
在全球女性的癌症中，乳腺癌的发病率处于第一位。乳腺虽然不是人体生命活动的必需组织，但是乳腺组织细胞癌变之后细胞连接松散，极易脱落，且脱落的癌细胞会随着血液循环或者淋巴循环系统转移全身，引起其他组织的癌变，最终危及生命。三阴性乳腺癌(triplenegativebreastcancer，TNBC)是乳腺癌的一种亚型，其孕激素受体、雌激素受体、与人类表皮生长因子受体2的表达均为阴性。三阴性乳腺癌占所有乳腺癌的10.0％～20.8％，具有特殊的临床病理特征和生物学行为，预后较其他乳腺癌亚型差。三阴性乳腺癌特点是死亡率高，并伴有较高的脑、肺、肝转移倾向。由于三阴性乳腺癌的异质性和缺少较为明确的分子靶点，所以至今临床上没有具有针对性的治疗方案，化疗依然是标准治疗方法。因此只有不到30％的患者能存活5年，并且即使有系统的治疗，平均存活时间也只有13.3个月，几乎所有TNBC患者最终会死亡。因此了解三阴性乳腺癌的有效的分子靶点并研究如何针对该靶点进行治疗就显得尤为重要。据发表在JClinOncol.上的文献(PMID:26169618DOI:10.1200/JCO.2014.59.7682)报道，Penk蛋白被证实为乳腺癌发生及发展的标志物。绝经后妇女血浆中penk水平与乳腺癌的发生呈负相关，血浆中penk低表达的女性乳腺癌发病的风险比较高。penk表达下调会导致细胞粘附及运动，极大增加脑转移的风险。Penk的水解产物为脑啡肽，在免疫系统与神经内分泌的分子联系中发挥重要作用。脑啡肽可以结合中枢神经系统中的受体分子，通过下丘脑-垂体-肾上腺通路对机体进行调控，提高机体的抗肿瘤能力及免疫反应。我们之前的研究表明penk在三阴性乳腺癌肿瘤组织中显著下调，当诱导penk过表达时，癌细胞的增殖、侵袭与迁移都受到明显的抑制，并能诱导细胞凋亡与细胞周期阻滞。因此，penk是调控三阴性乳腺癌细胞生命活动的重要作用因子，通过研究如何靶向提高penk表达量是获得良好治疗效果的关键。在当前的研究领域，miRNA是一种熟知的能够靶向调节基因表达的物质。miRNA是由内源基因编码的单链RNA分子，长度在19到25个核苷酸左右。大多数miRNA基因以单拷贝、多拷贝或基因簇的形式存在于基因组中。miRNA主要是通过特异性结合靶mRNA的3'端非翻译区(3'-untranslatedregion，3'-UTR)，使靶标mRNA翻译抑制或降解，降低相应蛋白质的表达，参与动植物的转录后调控过程，进而影响细胞的增殖、转移、凋亡等一系列生命活动。据发表在PharmacolTher.的文献(PMID:27916656DOI:10.1016/j.pharmthera.2016.11.012)报道，miRNA在乳腺细胞里的异常表达是造成乳腺癌的重要原因，并与乳腺癌细胞的增殖、转移、侵袭及凋亡等生物学过程息息相关。此外，miRNA还会介导三阴性乳腺癌的耐药过程。因此，通过对miRNA功能的研究确定其在细胞生命活动中承担的作用，是实现靶向治疗重大疾病的关键途径。目前还没有通过miRNA途径靶向提高三阴性乳腺癌细胞内penk表达量的研究，因此，探索penk相关的TNBC发病机制，寻找相对应的miRNA作为治疗TNBC的分子靶点，对TNBC的治疗具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术解决的技术问题是：针对三阴性乳腺癌缺乏明确的分子靶点，本专利技术的目的在于提供靶向三阴性乳腺癌PENK基因的miR-506序列及其应用。本专利技术的技术方案是：一种能靶向三阴性乳腺癌PENK基因的miR-506序列，其特征在于，序列结构为：5’-UAAGGCACCCUUCUGAGUAGA-3’。本专利技术的进一步技术方案是：一种miR-506序列的应用，其特征在于，包括以下步骤：步骤一、根据miR-506的序列合成得到miR-506模拟物和miR-506抑制物；步骤二、将miR-506模拟物及抑制物分别转染到三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231中，达到影响penk表达的目的，包括以下子步骤：子步骤一：使用MTT法检测转染miR-506模拟物及抑制物的MDA-MB-231细胞，得到miR-506抑制三阴性乳腺癌细胞的增殖；子步骤二：使用流式细胞仪检测转染miR-506模拟物及抑制物的MDA-MB-231细胞，得到miR-506诱导三阴性乳腺癌细胞的周期阻滞；子步骤三：使用流式细胞仪检测转染miR-506模拟物及抑制物的MDA-MB-231细胞，得到miR-506促进三阴性乳腺癌细胞的凋亡；子步骤四：使用划痕实验法检测转染miR-506模拟物及抑制物的MDA-MB-231细胞，得到miR-506抑制三阴性乳腺癌细胞的迁移；子步骤五：使用transwell小室检测转染miR-506模拟物及抑制物的MDA-MB-231细胞，得到miR-506抑制三阴性乳腺癌细胞的侵袭；步骤三、将miR-506模拟物构建局部缓释体系，作用于裸鼠乳腺癌模型，包括以下子步骤：子步骤一：构建裸鼠乳腺癌模型：选取3-4周龄的BABL/c雌性裸鼠，将足量的与基质胶混合好的三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞注射到裸鼠左胸第二对脂肪垫下，观察肿瘤形成状况，得到裸鼠乳腺癌模型；子步骤二：以明胶纳米微球作为载体，每只裸鼠按照如下配制：明胶纳米微球缓释体系总体积为120μL。取32.5μL2000加入到45μLOpti-MEM，取10μL浓度为1μg/μL的miR-506加入到32.5μLOpti-MEM,轻弹混匀，静置5min。将RNA加到2000中，室温静置20min。将混合物与16mg明胶纳米微球混合，4℃静置1h混匀，得到miR-506局部缓释体系；子步骤三：用1mL注射器在裸鼠肿瘤周围注射120μLmiR-506局部缓释体系；子步骤四：给药处理20天后，处死裸鼠，剥离肿瘤，计算肿瘤体积，检测肿瘤标志物，Tunel染色检测肿瘤细胞凋亡状况。得到miR-506可有效抑制三阴性乳腺癌肿瘤的结论。专利技术效果本专利技术的技术效果在于：[1]本专利技术通过miRWalk2.0、miRBase、TargetScanHuman7.0数据库筛选以及qRT-PCR技术检测三阴性乳腺癌病人组织样本，证实miR-506在三阴性乳腺癌表达显著下降，平均下调88.95％。[2]本专利技术证实miR-506与Penk能直接相互作用。[3]本专利技术证实miR-506通过靶向提高penk的含量影响三阴性乳腺癌细胞的增殖、转移和侵袭。[4]本专利技术通过裸鼠乳腺癌模型检测miR-506靶向penk抑制三阴性乳腺癌肿瘤进展的有效性。结果表明miR-506能通过靶向penk抑制三阴性乳腺癌肿瘤的发展。因此利用miR-506能为药物治疗、基因治疗等临床应用提供治疗靶点和重要理论依据。<本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种能靶向三阴性乳腺癌PENK基因的miR-506序列，其特征在于，序列结构为：5’-UAAGGCACCCUUCUGAGUAGA-3’。/n

【技术特征摘要】
1.一种能靶向三阴性乳腺癌PENK基因的miR-506序列，其特征在于，序列结构为：5’-UAAGGCACCCUUCUGAGUAGA-3’。


2.一种基于权利要求1所述的miR-506序列的应用，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、根据miR-506的序列合成得到miR-506模拟物和miR-506抑制物；
步骤二、将miR-506模拟物及抑制物分别转染到三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231中，达到影响penk表达的目的，包括以下子步骤：
子步骤一：使用MTT法检测转染miR-506模拟物及抑制物的MDA-MB-231细胞，得到miR-506抑制三阴性乳腺癌细胞的增殖；
子步骤二：使用流式细胞仪检测转染miR-506模拟物及抑制物的MDA-MB-231细胞，得到miR-506诱导三阴性乳腺癌细胞的周期阻滞；
子步骤三：使用流式细胞仪检测转染miR-506模拟物及抑制物的MDA-MB-231细胞，得到miR-506促进三阴性乳腺癌细胞的凋亡；
子步骤四：使用划痕实验法检测转染miR-506模拟物及抑制物的MDA-MB-231细胞，得到miR-506抑制三阴性乳腺癌细胞的迁移；
子步骤五：使用tran...

【专利技术属性】
技术研发人员：张辰艳，刘杰，刘文婧，尹大川，杨长青，刘新利，董凯，赵士淇，
申请(专利权)人：西北工业大学，
类型：发明
国别省市：陕西;61