丙酮丁醇梭菌中的一个非编码RNA及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种RNA分子，其序列为SEQ ID NO:1。该非编码RNA分子在丙酮丁醇梭菌中的过表达能够提高菌株的生长速率和有机溶剂生产能力。

A noncoding RNA from Clostridium acetobutanol and its application

【技术实现步骤摘要】
丙酮丁醇梭菌中的一个非编码RNA及其应用
本专利技术属于基因工程领域，涉及丙酮丁醇梭菌中的一个非编码RNA及其应用，具体涉及一种RNA分子、及其用于提高丙酮丁醇梭菌生产有机溶剂能力的用途。
技术介绍
产溶剂梭菌是一类具有特殊分解与合成代谢途径的厌氧微生物，其底物谱宽泛，能够利用糖质原料、秸秆类木质纤维原料乃至一碳气体(CO，CO2)，且产物种类丰富，可天然合成多种大宗化学品及燃料，包括丙酮、乙醇、丁醇、己醇、1，3-丙二醇和氢气等。因此，产溶剂梭菌作为重要的工业微生物受到广泛关注，例如专利技术专利CN201210163123.8报道了丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)用于生产丁醇、丙酮和乙醇的研究。虽然利用产溶剂梭菌发酵生产有机溶剂和化学品具有广阔的应用前景，但与大肠杆菌、酿酒酵母等工业微生物相比，产溶剂梭菌在菌株生长速率、溶剂产物合成效率及产量方面仍有较大差距，亟待进一步改造和优化。造成产溶剂梭菌遗传改造进展缓慢的一个主要原因是我们对这类厌氧微生物的重要生理、代谢过程及其调控机制缺乏深入理解，对与细胞性能相关的功能基因缺乏全面、深入的发掘，从而无法为菌株改造提供有效信息和靶点。目前，产溶剂梭菌中被鉴定的与溶剂生成相关的功能基因数量极为有限，这远远满足不了产溶剂梭菌的代谢改造需求。研究表明，非编码小RNA(smallnoncodingRNA，sncRNA)是生物体中重要的调控元件，其可以对细胞重要的代谢活动和生理过程发挥影响。近些年，随着研究的不断深入，越来越多的sncRNA被鉴定并应用到菌株的代谢改造中。然而，与植物和动物相比，微生物中针对sncRNA的研究主要局限在少数物种中，如大肠杆菌和枯草芽孢杆菌等。至今，在产溶剂梭菌中只有少数几个sncRNA的功能被解析。有鉴于此，专利技术人借助全基因组水平突变体库筛选的方法，经过大量的研究实验，发现丙酮丁醇梭菌Clostridiumacetobutylicum的cac2384基因的启动子(P2384)中包含一段小RNA(sRNA)的编码序列，该sRNA为一段94nt的功能序列，不具备编码蛋白的能力，因此是非编码小RNA(sncRNA)。该sncRNA(命名为sr2384)的编码序列位于基因cac2384上游非编码区，其上游部分序列与cac2383的编码框重叠。在此基础上，我们利用在线sRNA二级结构分析软件RNAfoldWebServer对该sr2384进行二级结构预测，结果表明在sr2384二级结构中含有两段茎环结构。通过抑制丙酮丁醇梭菌中sr2384的表达水平，菌株的生长及产溶剂能力均明显降低；相反，利用不同强度启动子强化sr2384表达后，菌株的生长优于对照菌株，同时产溶剂时间明显提前，这表明适量强化sr2384的表达可以显著改善菌株性能。
技术实现思路
专利技术人在丙酮丁醇梭菌中筛选得到的溶剂生成相关非编码小RNA(sr2384)的强化表达显著提升了菌株的发酵表型，表明其是一类重要的菌株遗传改造靶点，为后续产溶剂梭菌的代谢工程设计和改造提供了新思路，有助于构建更具工业化应用潜力的的产溶剂梭菌。上述发现构成了本专利技术的基础。具体而言，本专利技术包括如下技术方案。一种RNA分子，其序列为SEQIDNO:1：5’-UACCUUUCUAGCAUAUAUUACAUGCAAACCUUACCCUCCUUUCUAUCCAUAUCUAUACAAAUUUAUUCCUUAAAAAAAAAUAUAUGAAUGAAUA-3’(SEQIDNO:1)。根据本专利技术的第二个方面，提供了一种RNA表达框，其包含上述RNA分子的模板DNA序列SEQIDNO:2：5’-TACCTTTCTAGCATATATTACATGCAAACCTTACCCTCCTTTCTATCCATATCTATACAAATTTATTCCTTAAAAAAAAATATATGAATGAATA-3’(SEQIDNO:2)。优选上述表达框的DNA序列为SEQIDNO:3：5’-ACACAAAAAATTAAAAGAAAAATGGGAAAAAATAGCTTTTTCACGCATACCTTTCTAGCATATATTACATGCAAACCTTACCCTCCTTTCTATCCATATCTATACAAATTTATTCCTTAAAAAAAAATATATGAATGAATATAAAAAAAACACAAAAACTATTTATAGAATCATAGATAAAACTTAAGTTATCGTTGTTAAAACCTAAAGTATCTTTAACAGCATAACTTAATAAACATCTGATTCTCATATATCAAATTTTAAGGAGGTTACAAAATG-3’(SEQIDNO:3)。根据本专利技术的第三个方面，提供了一种质粒，其包含上述模板DNA序列SEQIDNO:2、或者上述RNA表达框。根据本专利技术的第四个方面，提供了一种丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)，其是包含了上述质粒的转化子。上述RNA分子或者上述丙酮丁醇梭菌能够用于生产有机溶剂，所述有机溶剂包括丁醇、丙酮和/或乙醇。根据本专利技术的另一个方面，提供了一种提高丙酮丁醇梭菌生产有机溶剂能力的方法，包括以下步骤：A.构建用于表达上述RNA分子的质粒；B.将步骤A中构建的质粒转化入丙酮丁醇梭菌中，筛选出过表达所述RNA的阳性克隆。上述步骤B中所述转化为氯化钙转化法或电转化，优选电转化。优选地，上述方法可以进一步包含步骤C.通过发酵实验，筛选验证得到有机溶剂生产能力提高的菌株，所述有机溶剂选自丁醇、丙酮和乙醇。上述步骤C中所述发酵实验的条件是：P2培养基，8％(w/v)葡萄糖，5％(v/v)的接种量，37℃，厌氧发酵。在一种优选的实施方式中，上述丙酮丁醇梭菌是ClostridiumacetobutylicumATCC824。上述步骤A中的质粒骨架选自穿梭质粒pIMP1和pXY1。在一种优选的实施方式中，上述质粒包含thl启动子SEQIDNO:4、200-1启动子SEQIDNO:5、或者1200-9-15启动子SEQIDNO:6：5’-TTTTTAACAAAATATATTGATAAAAATAATAATAGTGGGTATAATTAAGTTGTTAGAGAAAACGTATAAATTAGGGATAAACTATGGAACTTATGAAATAGATTGAAATGGTTTATCTGTTACCCCGTATCAAAATTTAGGAGGTTAGTTAGAGTCGACTCTAGAGGATCC-3’(SEQIDNO:4)；5’-TTTTTAACAAAATATTTTGAGAGACATGGATGCCCTATGCTATAATGTAGTTGTTAGAGAAAACGTATAAATTAGGGATAAACTATGGAACTTATGAAATAGATTGAAATGGTTTATCTGTTACCCCGTATCAAAATTTAGGAGGTTAGTTAGAGT本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种RNA分子，其序列为SEQ ID NO:1。/n

【技术特征摘要】
1.一种RNA分子，其序列为SEQIDNO:1。


2.一种RNA表达框，其包含如权利要求1所述RNA分子的模板DNA序列SEQIDNO:2。


3.如权利要求2所述的RNA表达框，其特征在于，表达框的DNA序列为SEQIDNO:3。


4.包含如权利要求2中所述模板DNA序列SEQIDNO:2、或者如权利要求2或3所述RNA表达框的质粒。


5.转化了如权利要求4所述质粒的丙酮丁醇梭菌。


6.如权利要求1所述RNA分子、如权利要求4所述质粒或者如权利要求5所述丙酮丁醇梭菌在生产有机溶剂中的用途，所述有机溶剂选自丁醇、丙酮和乙醇。


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【专利技术属性】
技术研发人员：顾阳，杨云鹏，郎楠楠，姜卫红，
申请(专利权)人：中国科学院上海生命科学研究院，
类型：发明
国别省市：上海;31