一种人内源性27nt-miRNA分子在制备抗肿瘤药物中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种人内源性27nt‑miRNA分子在制备抗肿瘤药物中的应用。其中，人内源性27nt‑miRNA分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明专利技术的小分子物质是一种具有抗肿瘤作用的新型物质，为癌症在分子水平的诊治提供依据，并为阐明其在肿瘤的作用机制提供研究基础。

Application of a human endogenous 27nt miRNA molecule in the preparation of antitumor drugs

【技术实现步骤摘要】
一种人内源性27nt-miRNA分子在制备抗肿瘤药物中的应用
本专利技术属于基因工程
，具体地说，涉及一种人内源性27nt-miRNA分子在制备抗肿瘤药物中的应用。
技术介绍
microRNAs(miRNAs)属于一类长度为21-30个核苷酸的小片段RNA。1990年，两组研究人员在植物的研究中意外发现色素基因表达的“协同抑制现象(cosupression)”，随后导致RNA干扰(RNAinterfering,RNAi)技术的出现。自1993年Ambros及其合作者发现第一个被称为lin-4的miRNA以来，迄今已在人类基因组中已经鉴定出超过1000个在各种特定的组织中表达的miRNA。从已有的研究资料来看，miRNAs主要由以下几个特征：(1)存在的广泛性。miRNAs几乎存在于所有的真核组织细胞，其表达可能以成簇的方式较多见；(2)结构的特殊性。miRNAs不具有开放阅读框架，在其5’-端有一个磷酸基团，3’-端有一个羟基，有别于一般的寡核苷酸或RNA降解片断。(3)高度保守性。大多数miRNAs存在种属高度保守，可能在物种进化中有重要意义。(4)组织特异性。miRNAs的表达在各组织细胞中不同，可能涉及个体发育过程中的组织特异性基因表达调节。目前，国内外对miRNAs的内源性调节作用及其所具有的生理学和病理学意义的研究取得许多成就，总结起来有以下几个方面的进展：miRNAs参与细胞增殖或凋亡的内源性调节，miRNAs参与细胞分化过程的调控，miRNAs参与宿主细胞免疫防御功能的调节及其对心血管系统疾病相关基因有重要的调节作用等。更令人感兴趣的是，越来越多的资料显示，miRNAs在癌症的发生发展过程中具有重要的作用。miRNAs与鼻咽癌。鼻咽癌是一种由鼻咽内膜引起的肿瘤性疾病，是我国的高发肿瘤之一，常见于南方地区，以广东、广西发病率最高。从广西鼻咽癌死亡率来看，男性为5.98/10万，女性为2.72/10万，排行全国第二。从1990年和2005年两次死因抽样调查表明，广西鼻咽癌死亡占恶性肿瘤死亡的第四位。遗憾的是，鼻咽癌的发病机制复杂，目前这一疾病的病因不明，对其病理发生发展的机制也不清楚，认为主要与遗传易感性、EB病毒感染等有关，因此缺乏彻底地、高效地根治这一疾病的防治措施。近年来越来越多研究发现，miRNAs参与鼻咽癌的发生发展。miRNAs可抑制鼻咽癌细胞增殖、迁移和侵袭，影响鼻咽癌的血管新生及转移等。体外试验发现，沉默miR-98的表达诱导的细胞增殖、迁移和侵袭，促进异种移植瘤的体内生长。在鼻咽癌细胞中，miR-29c的表达下调可导致下游多种靶基因的表达上调,使细胞外基质蛋白(如胶原蛋白及层粘连蛋白-1)参与鼻咽癌细胞的转移。miRNAs在鼻咽癌组织或细胞的表达。有研究利用高度敏感的微阵列技术分析了鼻咽癌和正常健康的鼻咽上皮样本，确定了8种miRNA的差异表达，miR-29c、miR-34b、miR-34c、miR-212、miR-216和miR-217在肿瘤细胞中表达水平下降，miR-151和miR-192表达上升。其中miR-29c的表达水平仅为正常鼻咽上皮细胞的1/5。另有研究在13个鼻咽癌样本和9个邻近正常组织中鉴定出270种miRNA的表达，并确定了35个miRNA在鼻咽癌样本中表达有明显差异性。其中miR-98在鼻咽癌组织和鼻咽癌细胞系均显著降低。其它基因，如miR-9、miR-26a、let-7、miR-200以及miR-451等在鼻咽癌组织中表达水平下降，从而促进鼻咽癌的发生发展。miR-18a和miR-18b在鼻咽癌组织中高度表达。miRNAs与其它肿瘤。miRNAlet-7在人类肺癌中的低表达，60％的肺癌细胞株中let-7的表达水平显著下降；let-7的过表达能够抑制肺癌细胞的生长。实时荧光定量PCR法分析肺癌中miR-146b-5p的表达水平降低至少50％；相反，miR-21在肺癌中表达水平显著升高。研究发现miR-221在肝癌肿瘤组织和细胞中过表达。抑制培养的肝癌细胞中miR-221的表达，则细胞的增殖、迁移和入侵能力下降。也有研究发现69个miRNAs在肝癌和相应的癌旁组织中差异表达，并确定miR-125b对肝癌预后具有预测意义。应用miRNA克隆技术在结肠癌和周围正常黏膜组织中检测到miR-143和miR-145在癌组织中表达明显降低。目前对皮下注射含外源性microRNA小分子物质的癌细胞的移植瘤研究较少，因此有必要提供一种新的皮下移植瘤模型用于探讨某些新型分子型抗肿瘤药物的研究应用。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术针对难治性鼻咽癌效果亦不佳，无新的更好的治疗手段的问题，提供了一种一种人内源性27nt-miRNA分子在制备抗肿瘤药物中的应用。为了解决上述技术问题，本专利技术公开了一种人内源性27nt-miRNA分子在制备抗肿瘤药物中的应用。可选地，所述的人内源性27nt-miRNA分子的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术还公开了一种含有上述的人内源性27nt-miRNA分子重组表达质粒、表达盒、转基因细胞系或重组菌。本专利技术还公开了一种含有上述的人内含子源性27nt-miRNA的重组表达质粒的构建方法，包括以下步骤：通过NCBI中的Blast系统得到人内含子源性27nt-miRNA核苷酸序列，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；经PCR扩增目的基因片段，双酶切后线性连接，再应用北京天根生化科技有限公司小量提取试剂盒提取质粒，取阳性克隆菌液送公司进行测序鉴定，得到人内含子源性27nt-miRNA小分子物质高表达质粒。可选地，PCR扩增反应体系为：10ng/μL模板1μL，32.5μLddH2O，10μL5×PSBuffer，2.5mMeachdNTPMix4μL，10μM上游扩增引物1μL，10μM下游扩增引物1μL，0.5μLPrimeSTARHSDNApolymerase。可选地，PCR扩增反应条件为：95℃5min，1循环，98℃10s，55℃10s，72℃90s，30循环；72℃8min，4℃24h。可选地，PCR扩增的上游扩增引物:5’-GGAAGTCTAGACCTGCTGCA-3’，如SEQIDNO.2所示；下游扩增引物:5’-GTCGGTGTCGTGGAGTCG-3’，如SEQIDNO.3所示。与现有技术相比，本专利技术可以获得包括以下技术效果：本专利技术提供具有抗肿瘤作用的新型小分子物质27nt-miRNA，通过应用DNA重组技术和microRNA合成技术得到其高表达质粒，通过与脂质体孵育转染鼻咽癌细胞，观察其在细胞水平的抗肿瘤作用，再将此质粒皮下注射到成功制瘤的裸鼠体内，观察其对裸鼠皮下移植瘤的影响，明确其抗肿瘤作用，并在分子水平提供新型的鼻咽癌抗肿瘤治疗方式。当然，实施本专利技术的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。附图说明此处所说明的附图用来提供对本专利技术的进一步理解，构成本专利技术的一部分，本专利技术的示意性实施例本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种人内源性27nt-miRNA分子在制备抗肿瘤药物中的应用。/n

【技术特征摘要】
1.一种人内源性27nt-miRNA分子在制备抗肿瘤药物中的应用。


2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的人内源性27nt-miRNA分子的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。


3.含有权利要求1或2所述的人内源性27nt-miRNA分子重组表达质粒、表达盒、转基因细胞系或重组菌。


4.一种含有权利要求1所述的人内含子源性27nt-miRNA的重组表达质粒的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
通过NCBI中的Blast系统得到人内含子源性27nt-miRNA核苷酸序列，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；经PCR扩增目的基因片段，双酶切后线性连接，再应用北京天根生化科技有限公司小量提取试剂盒提取质粒，取阳性克隆菌液送公司进行测序鉴定，得到人内含子源性27nt-miRNA小分子物质高表达质粒。

【专利技术属性】
技术研发人员：欧和生，罗雪兰，杨鹏，
申请(专利权)人：广西国际壮医医院，
类型：发明
国别省市：广西;45