本发明专利技术公开了Cas9介导的麻竹基因编辑载体及其应用。发明专利技术通过构建Crispr/Cas9麻竹表达载体，通过农杆菌（EHA105）转化的方式，将Cas9基因导入麻竹中，对麻竹PSY1基因进行定向编辑，首次提供一种能够定向编辑麻竹自身基因从而获得麻竹突变体的方法。证明了CRISPR/Cas9在竹子中的适用性，从而促进了未来竹子的研究和育种。
【技术实现步骤摘要】
Cas9介导的麻竹基因编辑载体和应用
本专利技术属于生物技术和遗传育种领域，具体涉及Cas9介导的麻竹基因编辑载体，还涉及该基因编辑载体的应用。
技术介绍
竹是一种特殊的草种，具有重要的经济价值和生态价值。约25亿人直接生产和消费竹子，2018年国际贸易额达到688亿美元(国际竹藤组织数据)。亚洲主要竹种之一是麻竹具有三个亚基因组的六倍体物种(2n=72,AABBCC)尽管竹子在农艺上很重要，但传统育种几乎不可能改变竹子的性状，因为竹子需要70多年才能开花。由于缺乏有效的基因操作工具，竹材的研究在很大程度上滞后。CRISPR(有规律的间隔短回文重复聚类)/Cas9为许多植物的基因组编辑提供了直接的方法，但从未在竹子中应用过。在这里，本专利技术利用CRISPR/Cas9技术通过靶向一个特定的拷贝或所有同源基因来产生竹子突变体。类胡萝卜素在植物当中有许多作用，同时与人类是生活也是息息相关。八氢番茄红素合成酶PSY1基因在番茄(SlPSY1和SlPSY2)等dicot植物和玉米(ZmPSY1-3)、水稻(OsPSY1-3)、高粱(SbPSY1-3)等单子叶植物中很常见。是类胡萝卜素合成途径上的一个起主要作用的酶。从目前的研究而言，PSY基因家族属于一个比较小的基因家族，在不同的物种中分别存在一至三个家族成员（最多不会超过3个）。
技术实现思路
本专利技术的目的在于：运用高效的基因编辑技术，提供一个改造麻竹八氢番茄红素合成酶PSY1基因的方法。该方法利用农杆菌作为转化方式，通过构建Crispr/Cas9麻竹表达载体进行麻竹遗传转化，以此获得定点编辑的麻竹突变体植株。本专利技术的技术方案：选择竹子中假定的八氢番茄红素合成酶PSY1如SEQIDNo.4所示，其在玉米中的同源酶在类胡萝卜素生物合成中起作用。通过同源克隆策略首次识别和克隆了竹类PSY1等位基因(DlmPSY1-A、DlmPSY1-B、DlmPSY1-C)。为了使所有DlmPSY1拷贝发生突变，设计了针对所有DlmPSY1基因座保守位点的sgRNA1(图2)。此外，本专利技术还在3个DlmPSY1等位基因的间隔区选择了sgRNA2靶区包含2-3个单核苷酸多态性(SNPs)的位点，检测sgRNA错配的耐受性(图2)。所述sgRNA1和sgRNA2的序列如下：sgRNA1：gaggtccggccagcctcccccgg；sgRNA2：gcgcggcacctccaggtccttgg。选取水稻OsU6b启动子来表达sgRNA片段，因为竹子与水稻具有高度的基因组联合性OsU6b启动子引物序列如SEQIDNo.3所示。一种麻竹定向编辑的CRISPR/Cas9表达载体，该载体包括Ubi启动子、Cas9基因、Osu6b启动子、sgRNA；所述CRISPR/Cas9表达载体的Ubi启动子连接Cas9基因，由Osu6b启动子调节sgRNA，Ubi启动子序列如SEQIDNo.2所示；Osu6b启动子如SEQIDNo.3所示。一种定向编辑麻竹基因的方法，采用上述麻竹改造的载体，通过以下步骤：（1）以PUBI-H载体为基础，将其与OsU6b启动子和sgRNA连接，构建得到Crispr/Cas9麻竹转化载体，所述PUBI-H载体的基础核苷酸序列如SEQIDNo.1所示；（2）将构建好的Crispr/Cas9载体转入农杆菌EHA105，并对麻竹愈伤进行侵染；（3）将侵染后的愈伤放置于MS培养基上进行愈伤筛选、增殖、分化培养；（4）将分化后的小苗移入培养罐进行培养，PCR鉴定；（5）筛选阳性苗、获得定向编辑的麻竹突变体植株；（6）对被编辑基因进行PCR分析，统计该基因编辑体系的编辑效率和编辑类型。上述方法中PCR鉴定的引物为（1）HYG抗性鉴定如SEQIDNo.7、SEQIDNo.8所示（2）Cas9鉴定如SEQIDNo.9、SEQIDNo.10所示。有益效果：本专利技术通过比对毛竹PSY1基因，首次克隆出麻竹体内的三个DlmPSY基因（DlmPSY-1、DlmPSY-2、DlmPSY-3）。通过构建Crispr/Cas9载体，将该载体通过农杆菌（EHA105）导入麻竹体内，对麻竹DlmPSY基因进行定向的编辑。首次获得麻竹的转基因突变体，开创将Crispr/Cas9应用于麻竹的研究先河，将麻竹的研究提升到了一个新的高度，为之后的满足相关研究提供了一个广阔的平台。附图说明图1：PUBI-H载体图谱图2：DlmPSY1基因结构和靶位点序列。灰色的方框：外显子；黑线：内含子；括号内数字：起始密码子、终止密码子和sgRNA目标位置；sgRNAs和DlmPSY1基因的PAM区域(方框内)、SNPs(划线)和核苷酸序列。图3：HYG抗性鉴定与Cas9鉴定电泳胶图结果示范例。图4：DlmPSY1sgRNA1位点的插入频率(左)和突变类型(右)。分别插入或删除bp用i#和d#表示；d≥14:删除大于14bp;i+d:删除和插入在目标位点。图5：DlmPSY1sgRNA2位点的插入频率(左)和突变类型(右)。分别插入或删除bp用i#和d#表示；d≥14:删除大于14bp;i+d:删除和插入在目标位点。图6：代表性DlmPSY1突变体的表型。a~c,野生型;d-f,DlmPSY1突变体(T0-1)。具体实施方式接下来将结合附图对本专利技术的实例进行详细的描述，若实例中有未注明的具体实验方式，默认按照常规标准的实验步骤进行，建议参考分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著)所建议的实验条件，或者采用试剂公司的产品说明书进行实验。实施例1麻竹PSY1基因与sgRNA位点的获得参考水稻已知PSY1的基因序列，进行毛竹PSY1基因blast比对并设计出麻竹PSY1对应的引物如SEQIDNo.11、SEQIDNo.12所示。将麻竹PSY1的序列全长克隆出来，如SEQIDNo.4所示。通过同源克隆策略识别和克隆了3个竹类PSY1等位基因(DlmPSY1-A、DlmPSY1-B、DlmPSY1-C)为了使所有DlmPSY1拷贝发生突变，设计了针对所有DlmPSY1基因座保守位点的sgRNA1。此外，本专利技术还在3个DlmPSY1等位基因的间隔区选择了sgRNA2靶区包含2-3个单核苷酸多态性(SNPs)的位点。所述sgRNA1和sgRNA2的序列如下：sgRNA1：gaggtccggccagcctcccccgg；sgRNA2：gcgcggcacctccaggtccttgg。实施例2表达载体的构建PUBI-H载体由刘耀光教授课题组引进（图1）（MaX,ZhangQ,ZhuQ,etal.ArobustCRISPR/Cas9systemforconvenient,high-efficiencymultiplexgenomeeditinginmonocotanddicotplants[本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种Cas9介导的改造麻竹八氢番茄红素合成酶PSY1基因的方法，其特征在于，针对麻竹基因组3个DlmPSY1等位基因座保守位点设计sgRNA1，并在3个DlmPSY1等位基因的间隔区选择了sgRNA2靶区包含2-3个单核苷酸多态性的位点，检测sgRNA错配的耐受性；所述sgRNA1和sgRNA2的序列如下：/nsgRNA1：gaggtccggccagcctcccccgg；/nsgRNA2：gcgcggcacctccaggtccttgg。/n
【技术特征摘要】
1.一种Cas9介导的改造麻竹八氢番茄红素合成酶PSY1基因的方法，其特征在于，针对麻竹基因组3个DlmPSY1等位基因座保守位点设计sgRNA1，并在3个DlmPSY1等位基因的间隔区选择了sgRNA2靶区包含2-3个单核苷酸多态性的位点，检测sgRNA错配的耐受性；所述sgRNA1和sgRNA2的序列如下：
sgRNA1：gaggtccggccagcctcccccgg；
sgRNA2：gcgcggcacctccaggtccttgg。
2.根据权利要求1所述一种Cas9介导的改造麻竹八氢番茄红素合成酶PSY1基因的方法，其特征在于，麻竹基因组PSY1基因的核苷酸序列如SEQIDNo.4所示。
3.一种麻竹定向编辑的CRISPR/Cas9表达载体，其特征在于：该载体Ubi启动子连接Cas9基因，由Osu6b启动子调节sgRNA，Ubi启动子序列如SEQIDNo.2所示；Osu6b启动子如...
【专利技术属性】
技术研发人员：朱强，叶善汶，陈刚，
申请(专利权)人：福建农林大学，
类型：发明
国别省市：福建;35
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。