提高了热稳定性的Phi29 DNA聚合酶突变体及其应用制造技术

提供一组提高了热稳定性的Phi29 DNA聚合酶突变体及其应用。所述Phi29 DNA聚合酶突变体是将phi29 DNA聚合酶进行点突变甲和/或点突变乙和/或点突变丙得到的蛋白质，所述点突变甲为将phi29 DNA聚合酶第97位氨基酸残基由M突变为其他氨基酸残基，所述点突变乙为将phi29 DNA聚合酶第123位氨基酸残基由L突变为其他氨基酸残基，所述点突变丙为将phi29 DNA聚合酶第515位氨基酸残基由E突变为其他氨基酸残基。所述Phi29 DNA聚合酶突变体的稳定性高于phi29 DNA聚合酶。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】提高了热稳定性的Phi29 DNA聚合酶突变体及其应用
本专利技术涉及提高了热稳定性的Phi29 DNA聚合酶突变体及其应用。
技术介绍
Phi29 DNA聚合酶是来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Phi29噬菌体的DNA聚合酶，属于B族DNA聚合酶。Phi29 DNA聚合酶的晶体结构显示，除了具有一般B族DNA聚合酶的保守的手掌(Palm)、拇指(Thumb)、手指(Finger)和外切(Exo)结构域外，Phi29 DNA聚合酶还拥有另外两个独特的结构域：TPR1和TPR2结构域。TPR2结构域参与形成围绕下游模板DNA链的狭小通道，迫使双链DNA的解离；与此同时，Palm、Thumb、TPR1和TPR2结构域形成圆圈状结构，紧密地结合在上游模板链形成的双链DNA上。Phi29 DNA聚合酶的结构特征赋予了其特殊的高持续合成能力和较强的链置换功能，以及3’→5’外切酶校正活性。常应用于微量的环状质粒的滚环扩增(Rolling Circle Amplification，RCA)或基因组的多重链置换扩增(Multiple Displacement Amplification，MDA)等恒温扩增过程，进一步地可应用于高通量测序的文库制备及链置换扩增等步骤。Phi29 DNA聚合酶是中温酶，热稳定性较差，65℃加热10min即可失活。在实际的应用中，常因此而影响Phi29 DNA聚合酶的产品储存期限、DNA扩增和测序的效果等。针对Phi29 DNA聚合酶的热稳定性改良及扩增效率优化，目前的研究主要从两方面展开：一方面是对储存缓冲液或反应缓冲液进行优化，比如加入一些表面活性剂或相溶性溶质；另一方面是对蛋白序列进行突变改造或构建嵌合体蛋白。现有的技术专利技术虽然在一定程度上改善了Phi29 DNA聚合酶的热稳定性，但对具有较高热稳定性Phi29 DNA聚合酶的改造还需持续进行。一方面是因为针对热稳定性的突变会对聚合酶的其他结构域功能造成影响，进而影响下游应用，结合不同应用对Phi29 DNA聚合酶的改造仍具有现实意义。另一方面，商业竞争和专利权的约束，也会趋使企业避开专利侵权风险，开发出自己的专利产品。专利技术公开本专利技术的目的是提供提高了热稳定性的Phi29 DNA聚合酶突变体及其应用。本专利技术提供了一种蛋白质，是将phi29 DNA聚合酶进行点突变甲和/或点突变乙和/或点突变丙得到的蛋白质；所述点突变甲为将phi29 DNA聚合酶第97位氨基酸残基由M突变为其他氨基酸残基；所述点突变乙为将phi29 DNA聚合酶第123位氨基酸残基由L突变为其他氨基酸残基；所述点突变丙为将phi29 DNA聚合酶第515位氨基酸残基由E突变为其他氨基酸残基。所述点突变甲具体可为将phi29 DNA聚合酶第97位氨基酸残基由M突变为H、A或K。所述点突变乙具体可为将phi29 DNA聚合酶第123位氨基酸残基由L突变为K、F、I或H。所述点突变丙具体可为将phi29 DNA聚合酶第515位氨基酸残基由E突变为G或P。所述蛋白质具体为如下(1)-(19)中的任一种：(1)将phi29 DNA聚合酶进行如下三个点突变，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质：第97位氨基酸残基由M突变为A，第123位氨基酸残基由L突变为H，第515位氨基酸残基由E突变为P；(2)将phi29 DNA聚合酶进行如下三个点突变，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质：第97位氨基酸残基由M突变为K，第123位氨基酸残基由L突变为I，第515位氨基酸残基由E突变为P；(3)将phi29 DNA聚合酶进行如下三个点突变，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质：第97位氨基酸残基由M突变为K，第123位氨基酸残基由L突变为F，第515位氨基酸残基由E突变为P；(4)将phi29 DNA聚合酶进行如下三个点突变，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质：第97位氨基酸残基由M突变为K，第123位氨基酸残基由L突变为H，第515位氨基酸残基由E突变为P；(5)将phi29 DNA聚合酶进行如下三个点突变，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质：第97位氨基酸残基由M突变为K，第123位氨基酸残基由L突变为K，第515位氨基酸残基由E突变为P；(6)将phi29 DNA聚合酶进行如下三个点突变，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质：第97位氨基酸残基由M突变为A，第123位氨基酸残基由L突变为F，第515位氨基酸残基由E突变为G；(7)将phi29 DNA聚合酶进行如下三个点突变，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质：第97位氨基酸残基由M突变为K，第123位氨基酸残基由L突变为H，第515位氨基酸残基由E突变为G；(8)将phi29 DNA聚合酶进行如下三个点突变，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质：第97位氨基酸残基由M突变为K，第123位氨基酸残基由L突变为I，第515位氨基酸残基由E突变为G；(9)将phi29 DNA聚合酶进行如下三个点突变，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质：第97位氨基酸残基由M突变为A，第123位氨基酸残基由L突变为H，第515位氨基酸残基由E突变为G；(10)将phi29 DNA聚合酶进行如下三个点突变，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质：第97位氨基酸残基由M突变为H，第123位氨基酸残基由L突变为I，第515位氨基酸残基由E突变为G；(11)将phi29 DNA聚合酶进行如下三个点突变，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质：第97位氨基酸残基由M突变为H，第123位氨基酸残基由L突变为H，第515位氨基酸残基由E突变为G；(12)将phi29 DNA聚合酶进行如下两个点突变，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质：第97位氨基酸残基由M突变为A，第123位氨基酸残基由L突变为I；(13)将phi29 DNA聚合酶进行如下两个点突变，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质：第97位氨基酸残基由M突变为H，第515位氨基酸残基由E突变为G；(14)将phi29 DNA聚合酶进行如下两个点突变，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质：第97位氨基酸残基由M突变为K，第515位氨基酸残基由E突变为G；(15)将phi29 DNA聚合酶进行如下一个点突变，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质：第97位氨基酸残基由M突变为A；(16)将phi29 DNA聚合酶进行如下一个点突变，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质：第97位氨基酸残基由M突变为K；(17)将phi29 DNA聚合酶进行如下一个点突变，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质：第123位氨基酸残基由L突变为K；(18)将phi29 DNA聚合酶进行如下一个点突变，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质：第515位氨基酸残基由E突变本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种蛋白质，是将phi29 DNA聚合酶进行点突变甲和/或点突变乙和/或点突变丙得到的蛋白质；所述点突变甲为将phi29 DNA聚合酶第97位氨基酸残基由M突变为其他氨基酸残基；所述点突变乙为将phi29 DNA聚合酶第123位氨基酸残基由L突变为其他氨基酸残基；所述点突变丙为将phi29 DNA聚合酶第515位氨基酸残基由E突变为其他氨基酸残基。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170728 CN 2017106309690一种蛋白质，是将phi29 DNA聚合酶进行点突变甲和/或点突变乙和/或点突变丙得到的蛋白质；所述点突变甲为将phi29 DNA聚合酶第97位氨基酸残基由M突变为其他氨基酸残基；所述点突变乙为将phi29 DNA聚合酶第123位氨基酸残基由L突变为其他氨基酸残基；所述点突变丙为将phi29 DNA聚合酶第515位氨基酸残基由E突变为其他氨基酸残基。


如权利要求1所述的蛋白质，其特征在于：
所述点突变甲为将phi29 DNA聚合酶第97位氨基酸残基由M突变为H、A或K；所述点突变乙为将phi29 DNA聚合酶第123位氨基酸残基由L突变为K、F、I或H；所述点突变丙为将phi29 DNA聚合酶第515位氨基酸残基由E突变为G或P。


如权利要求2所述的蛋白质，其特征在于：
所述蛋白质为如下(1)-(19)中的任一种：
(1)将phi29 DNA聚合酶进行如下三个点突变，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质：第97位氨基酸残基由M突变为A，第123位氨基酸残基由L突变为H，第515位氨基酸残基由E突变为P；
(2)将phi29 DNA聚合酶进行如下三个点突变，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质：第97位氨基酸残基由M突变为K，第123位氨基酸残基由L突变为I，第515位氨基酸残基由E突变为P；
(3)将phi29 DNA聚合酶进行如下三个点突变，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质：第97位氨基酸残基由M突变为K，第123位氨基酸残基由L突变为F，第515位氨基酸残基由E突变为P；
(4)将phi29 DNA聚合酶进行如下三个点突变，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质：第97位氨基酸残基由M突变为K，第123位氨基酸残基由L突变为H，第515位氨基酸残基由E突变为P；
(5)将phi29 DNA聚合酶进行如下三个点突变，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质：第97位氨基酸残基由M突变为K，第123位氨基酸残基由L突变为K，第515位氨基酸残基由E突变为P；
(6)将phi29 DNA聚合酶进行如下三个点突变，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质：第97位氨基酸残基由M突变为A，第123位氨基酸残基由L突变为F，第515位氨基酸残基由E突变为G；
(7)将phi29 DNA聚合酶进行如下三个点突变，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质：第97位氨基酸残基由M突变为K，第123位氨基酸残基由L突变为H，第515位氨基酸残基由E突变为G；
(8)将phi29 DNA聚合酶进行如下三个点突变，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质：第97位氨基酸残基由M突变为K，第123位氨基酸残基由L突变

为I，第515位氨基酸残基由E突变为G；
(9)将phi29 DNA聚合酶进行如下三个点突变，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质：第97位氨基酸残基由M突变为A，第123位氨基酸残基由L突变为H，第515位氨基酸残基由E突变为G；
(10)将phi29 DNA聚合酶进行如下三个点突变，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质：第97位氨基酸残基由M突变为H，第123位氨基酸残基由L突变为I，第515位氨基酸残基由E突变为G；
(11)将phi29 DNA聚合酶进行如下三个点突变，且保持其他的氨基酸序列不变得到的蛋白质：第97位氨基酸残基由M突变为...

【专利技术属性】
技术研发人员：张周刚，刘欢欢，郑越，周玉君，刘杏，董宇亮，徐崇钧，章文蔚，
申请(专利权)人：深圳华大智造科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44